Mésoscopique fluorescence tomographie pour In vivo L'imagerie du développement Drosophile</em

Summary

Mésoscopique de fluorescence de tomographie opère au-delà des limites de la pénétration des tissus sectionnement microscopie à fluorescence. La technique est basée sur la multi-projection de l'illumination et une description de transport des photons. Nous démontrons in vivo du corps entier de visualisation 3D de la morphogenèse des ailes exprimant la GFP dans les disques imaginaux<em> Drosophila melanogaster.</em

Abstract

Visualiser la formation des organes en développement ainsi que progession et le traitement de la maladie repose souvent lourdement sur la capacité à interroger optiquement les changements moléculaires et fonctionnelles dans les organismes vivants intacts. La plupart des méthodes existantes d'imagerie optique sont insuffisants pour l'imagerie à des dimensions qui se trouvent entre les limites de pénétration de la microscopie optique moderne (0,5-1mm) et les limites imposées par diffusion de la macroscopie optique (> 1 cm) [1]. Ainsi, de nombreux organismes modèles importants, par exemple insectes, des embryons animaux ou des extrémités du petit animal, restent inaccessibles pour l'imagerie in vivo optique.

Bien qu'il y ait un intérêt croissant envers le développement de nanomètre résolution méthodes d'imagerie optique, il n'ya pas eu beaucoup d'efforts réussi à améliorer la profondeur de pénétration d'imagerie. La capacité d'effectuer l'imagerie in vivo au delà des limites de microscopie est en fait rencontré des difficultés liées à la diffusion de photons présents dans les tissus. Les efforts récents pour embryons image entière par exemple [2,3] nécessitent un traitement chimique spécial de l'échantillon, pour les faire disparaître de la diffusion, une procédure qui permet de les utiliser uniquement pour l'imagerie post-mortem. Ces méthodes cependant des preuves de la nécessité pour les spécimens d'imagerie plus grandes que celles habituellement autorisés par microscopie à deux photons ou confocale, en particulier dans la biologie du développement et de découverte de médicaments.

Nous avons développé une nouvelle technique d'imagerie optique de fluorescence nommée mésoscopique tomographie [4], qui convient pour les non-invasives d'imagerie in vivo à des dimensions de 1mm à 5mm. La méthode de résolution des échanges pour la profondeur de pénétration, mais offre sans précédent de l'imagerie tomographique performance et il a été développé pour ajouter du temps comme une dimension nouvelle dans les observations de biologie du développement (et éventuellement d'autres domaines de la recherche biologique) en donnant la possibilité à l'image de l'évolution de la fluorescence taggés réponses au fil du temps. Comme telle, elle peut accélérer les études des dépendances morphologiques ou fonctionnelles sur les mutations des gènes ou des stimuli extérieurs, et peut surtout, capter l'image complète du développement ou de la fonction des tissus en permettant longitudinale time-lapse de visualisation de la même, l'organisme en développement.

La technique utilise un microscope de laboratoire modifié et multi-projection d'illumination pour recueillir des données à 360 degrés des projections. Elle s'applique à la simplification de Fermi à la solution de Fokker-Plank de l'équation de transport des photons, combinée avec les principes de l'optique géométrique afin de construire un système d'inversion réalistes adapté à une large échelle mésoscopique. Cela permet in vivo du corps entier de visualisation de la non-transparence des structures tridimensionnelles dans des échantillons de plusieurs millimètres dans la taille.

Nous avons démontré la performance in vivo de la technique par imagerie en trois dimensions des structures de développement de tissus in vivo chez la drosophile et en suivant la morphogenèse des ailes dans l'opaque pupes de drosophile en temps réel de plus de six heures consécutives.

Protocol

Les stocks de Drosophila melanogaster utilisés dans cette expérience sont les suivantes: elav-Gal4 (FBti0002575) AP-Gal4md544 (FBal0051787) SAMU-srcEGFP (FBti0013990) w1118 (FBal0018186) Pour toutes les expériences, le système UAS-Gal4 a été utilisé pour surexprimer la GFP dans les tissus d'intérêt (c'est à dire des glandes salivaires ou les disques d'aile). P…

Discussion

In vivo reconstructions de l'affaire de nymphe et les glandes salivaires exprimant la GFP d'un D. melanogaster prénymphe (barre d'échelle, 500 microns) avec l'histologie correspondante (en bleu, la coloration DAPI; vert, fluorescence de la GFP) est montré dans la figure 1 (a). Time-lapse série d'imagerie de D. melanogaster aile disques imaginaux est indiqué dans la Fig.1 (b). Les images sont acquises à partir d'un seul spécimen vivant, à quatre points de temps différent…