Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em
Summary
Mesoscópica fluorescência tomografia opera além dos limites de penetração de tecido de corte de microscopia de fluorescência. A técnica é baseada na projeção multi-iluminação e uma descrição do transporte de fótons. Demonstramos in-vivo visualização de corpo inteiro em 3D da morfogênese da GFP-expressando asa em discos imaginais<em> Drosophila melanogaster.</em
Abstract
Visualizando a formação de órgãos de desenvolvimento, bem como progession e tratamento da doença, muitas vezes depende fortemente da capacidade de interrogar opticamente alterações moleculares e funcionais em organismos vivos intactos. A maioria dos métodos existentes de imagens ópticas são inadequados para imagens em dimensões que se situam entre os limites de penetração de microscopia óptica moderna (0,5-1mm) e os limites de difusão-imposta de macroscopia óptica (> 1cm) [1]. Assim, muitos organismos modelo importante, insetos por exemplo, embriões de animais ou nas extremidades de pequenos animais, permanecem inacessíveis para a in-vivo de imagens ópticas.
Embora haja um interesse crescente para o desenvolvimento de métodos de resolução de nanômetros de imagem óptica, não tem havido muitos esforços bem sucedidos na melhoria da profundidade de penetração de imagem. A capacidade de executar in-vivo de imagens de microscopia para além dos limites é, de fato encontrou-se com as dificuldades associadas com o espalhamento de fótons presente nos tecidos. Esforços recentes para embriões imagem inteira, por exemplo, [2,3] necessitam de tratamento químico especial da amostra, para limpá-las de dispersão, um procedimento que os torna adequados apenas para pós-mortem de imagem. Estes métodos entanto evidência a necessidade de amostras maiores do que as imagens normalmente permitido por microscopia de dois fótons ou confocal, especialmente em biologia do desenvolvimento e na descoberta de medicamentos.
Nós desenvolvemos uma nova técnica de imageamento óptico chamado Mesoscópica Fluorescência Tomografia [4], que apropriado para não-invasivos de imagem in-vivo em dimensões de 1mm-5mm. O método de resolução de trocas de profundidade de penetração, mas oferece desempenho sem precedentes tomográfica de imagem e que foi desenvolvido para aumentar o tempo como uma nova dimensão em observações biologia do desenvolvimento (e possivelmente outras áreas da pesquisa biológica) por transmitir a capacidade de imagem da evolução da fluorescência tagged respostas ao longo do tempo. Como tal, pode acelerar os estudos de dependências morfológicas ou funcionais em mutações genéticas ou estímulos externos, e podem importante, capturar a imagem completa do desenvolvimento ou a função do tecido, permitindo a visualização de lapso de tempo longitudinal do organismo, mesmo em desenvolvimento.
A técnica utiliza um microscópio de laboratório modificados e multi-projecção de iluminação para coletar dados em 360 graus de projeções. Aplica-se a simplificação de Fermi Fokker-Plank solução da equação de transporte de fótons, combinados com princípios geométricos óptica, a fim de construir um esquema de inversão realista adequados para a faixa de mesoscópica. Isso permite que os in-vivo visualização de todo o corpo de não-transparente estruturas tridimensionais em amostras de até vários milímetros de tamanho.
Nós demonstramos o desempenho in vivo da técnica de imagem por estruturas tridimensionais de desenvolver tecidos Drosophila in-vivo e seguindo a morfogênese das asas na opaco Drosophila pupas em tempo real ao longo de seis horas consecutivas.
Protocol
Discussion
In vivo reconstruções do caso pupal e as glândulas salivares expressando GFP-de um D. melanogaster prepupa (Escala de bar, a 500 microns) com a histologia correspondente (azul, coloração DAPI; verde, GFP fluorescência) é mostrado na Figura 1 (a). Time-lapse série de imagem de D. discos melanogaster asa imaginal é mostrado na Fig.1 (b). As imagens são adquiridas a partir de um único espécime vivo, em quatro momentos diferentes (0,3.0, 3.5 e 6,5 horas). Na primeira projeção uma col…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. Vinegoni reconhece o apoio do National Institutes of Health (NIH) conceder 1-RO1-EB006432.
References
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- J, . Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).
