Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em
Summary
Mesoscópica fluorescencia tomografía opera más allá de los límites de penetración de los tejidos de seccionamiento microscopía de fluorescencia. La técnica se basa en la iluminación multi-proyección y una descripción del transporte de fotones. Se demuestra en vivo de todo el cuerpo visualización en 3D de la morfogénesis de las buenas prácticas agrarias-que expresa ala discos imaginales en<em> Drosophila melanogaster.</em
Abstract
Visualizar el desarrollo de la formación de órganos, así como progresión de la enfermedad y el tratamiento a menudo depende en gran medida la capacidad de interrogar ópticamente cambios moleculares y funcionales en los organismos vivos intactos. La mayoría de los métodos ópticos actuales imágenes son inadecuadas para las imágenes en las dimensiones que se encuentran entre los límites de la penetración de la microscopía óptica moderna (0,5-1mm) y los límites impuestos por difusión de macroscopía óptica (> 1 cm) [1]. Por lo tanto, muchos organismos modelo importantes, por ejemplo, los insectos, embriones de animales o en las extremidades de animales pequeños, siguen siendo inaccesibles para los in-vivo de imágenes ópticas.
Aunque hay un creciente interés hacia el desarrollo de métodos de resolución de nanómetros de imagen óptica, no ha habido muchos esfuerzos exitosos en el mejoramiento de la profundidad de penetración de imágenes. La capacidad de realizar en vivo de imágenes de microscopía allá de los límites es, de hecho, se reunió con las dificultades asociadas con la dispersión de fotones presentes en los tejidos. Los recientes esfuerzos para embriones toda la imagen, por ejemplo, [2,3] requieren un tratamiento químico especial de la muestra, para borrar de la dispersión, un procedimiento que hace que sean adecuadas sólo para la post-mortem de imágenes. Estos métodos sin embargo la evidencia la necesidad de que las muestras de imágenes más grandes que los que habitualmente se permite el microscopio de dos fotones o confocal, sobre todo en la biología del desarrollo y de descubrimiento de fármacos.
Hemos desarrollado una nueva técnica de imagen óptica llamada tomografía de fluorescencia mesoscópicas [4], que apropiado para no invasiva en vivo de imágenes en dimensiones de 1 mm a 5 mm. La resolución del método de intercambios para la profundidad de la penetración, pero ofrece un rendimiento de imagen sin precedentes, tomografía y se ha desarrollado para añadir el tiempo como una nueva dimensión en las observaciones de la biología del desarrollo (y posiblemente otras áreas de la investigación biológica), impartiendo la capacidad de la imagen de la evolución de la fluorescencia etiquetados respuestas a través del tiempo. Como tal, puede acelerar los estudios de las dependencias morfológicos o funcionales de las mutaciones del gen o los estímulos externos, y lo más importante puede capturar la imagen completa del desarrollo o la función del tejido, permitiendo longitudinal lapso de tiempo de visualización del mismo organismo, en desarrollo.
La técnica utiliza un microscopio de laboratorio modificados y multi-proyección de la iluminación para recoger datos en las proyecciones de 360 grados. Se aplica la simplificación de Fermi a la solución de Fokker-Planck de la ecuación de transporte de fotones, en combinación con los principios de la óptica geométrica con el fin de construir un plan de inversión realista adecuada para el rango mesoscópico. Esto permite a los in-vivo de todo el cuerpo de visualización de la falta de transparencia de estructuras tridimensionales en las muestras de hasta varios milímetros de tamaño.
Hemos demostrado la actuación en vivo de la técnica por imágenes en tres dimensiones de estructuras de desarrollo de los tejidos de Drosophila en vivo y después de la morfogénesis de las alas en la Drosophila pupas opaco en tiempo real de más de seis horas consecutivas.
Protocol
Discussion
En vivo-reconstrucciones de la envoltura pupal y las glándulas salivales que expresan GFP-de una D. melanogaster prepupa (Barra de escala, de 500 micras) con la histología correspondiente (azul, DAPI, de color verde, la fluorescencia de GFP) se muestra en la Fig. 1 (a). Time-lapse serie de imágenes de D. melanogaster ala discos imaginales se muestra en la Fig. 1 (b). Las imágenes se adquieren a partir de un espécimen vivo sola, en cuatro diferentes puntos de tiempo (0,3.0, 3.5 y 6.5 horas). En la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. Vinegoni reconoce el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de subvención 1-SR1-EB006432.
References
- Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- J, . Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).
