Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila</em
Summary
Mesoscopici fluorescenza tomografia opera oltre i limiti di penetrazione del tessuto-sezionamento microscopia a fluorescenza. La tecnica è basata su multi-proiezione di illuminazione e una descrizione di trasporto fotone. Abbiamo dimostrato in vivo di tutto il corpo visualizzazione 3D della morfogenesi della GFP che esprimono ala dischi immaginale in<em> Drosophila melanogaster.</em
Abstract
Visualizzazione formazione degli organi di sviluppo così come progession e trattamento della malattia spesso si basa pesantemente sulla capacità di interrogare otticamente cambiamenti molecolari e funzionali negli organismi viventi intatti. La maggior parte delle attuali metodi di imaging ottico sono inadeguati per l'imaging a dimensioni che si trovano tra i limiti di penetrazione della moderna microscopia ottica (0,5-1mm) e la diffusione imposto limiti di macroscopia ottica (> 1 cm) [1]. Così, molti organismi modello importante, ad esempio insetti, embrioni animali o delle estremità piccolo animale, restano inaccessibili per in vivo imaging ottico.
Anche se vi è un crescente interesse verso lo sviluppo di metodi di risoluzione nanometrica imaging ottico, non ci sono stati molti gli sforzi di successo per migliorare la profondità di penetrazione di imaging. La capacità di eseguire l'imaging in vivo oltre i limiti microscopia è infatti incontrato con le difficoltà associate con dispersione di fotoni presenti nei tessuti. Recenti tentativi di embrioni intera immagine per esempio [2,3] richiedono un trattamento speciale chimica del campione, per eliminarli dallo scattering, una procedura che li rende adatti solo per la post-mortem di imaging. Questi metodi tuttavia evidenza la necessità di esemplari immagini più grandi di quelle normalmente consentite dalla microscopia a due fotoni o confocale, in particolare in biologia dello sviluppo e nella scoperta della droga.
Abbiamo sviluppato una nuova tecnica di imaging ottico chiamato mesoscopici fluorescenza Tomografia [4], che appropriato per non invasiva in vivo immagini a dimensioni di 1mm-5mm. La risoluzione metodo scambi per profondità di penetrazione, ma offre prestazioni di imaging tomografico senza precedenti ed è stato sviluppato per aggiungere il tempo come una nuova dimensione nelle osservazioni biologia dello sviluppo (e forse altre aree di ricerca biologica), donando la possibilità di immagine l'evoluzione della fluorescenza tagged risposte nel tempo. Come tale, può accelerare gli studi delle dipendenze morfologiche o funzionali a mutazioni genetiche o stimoli esterni, e può, soprattutto, acquisire il quadro completo dello sviluppo o della funzione dei tessuti, permettendo longitudinale time-lapse visualizzazione degli stessi, organismo di sviluppo.
La tecnica utilizza un microscopio da laboratorio modificati e multi-proiezione di illuminazione per raccogliere i dati a 360 gradi proiezioni. Si applica la semplificazione Fermi di Fokker-Plank soluzione dell'equazione di trasporto di fotoni, in combinazione con i principi dell'ottica geometrica al fine di costruire un piano realistico inversione adatti per la gamma mesoscopici. Ciò consente di in-vivo di tutto il corpo visualizzazione di non trasparente strutture tridimensionali in campioni fino a diversi millimetri di dimensione.
Abbiamo dimostrato in vivo le prestazioni della tecnica di imaging di strutture tridimensionali di sviluppare tessuti Drosophila in vivo e seguendo la morfogenesi delle ali nel opaco Drosophila pupe in tempo reale oltre sei ore consecutive.
Protocol
Discussion
In vivo ricostruzioni del caso pupa e la GFP che esprimono ghiandole salivari di una D. melanogaster prepupa (Scala bar, 500 micron) con l'istologia corrispondente (blu, colorazione DAPI, verde, GFP fluorescenza) è mostrato in Fig. 1 (a). Time-lapse imaging di serie D. melanogaster ala dischi immaginale è mostrata in Fig.1 (b). Le immagini vengono acquisite da un singolo esemplare dal vivo, in quattro momenti diversi (0,3.0, 3,5 e 6,5 ore). Nella prima colonna una proiezione a 0 gradi rispetto al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. Vinegoni riconosce il sostegno di National Institutes of Health (NIH) concedere 1-RO1-EB006432.
References
- Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- J, . Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).
