Mesoskopisk Fluorescens Tomografi för In-vivo Imaging för att utveckla Drosophila</em
Summary
Mesoskopisk fluorescens tomografi verkar bortom penetration gränserna för vävnads-snittning fluorescensmikroskopi. Tekniken bygger på multi-projektion belysning och en foton transporter beskrivning. Vi visar in-vivo hela kroppen 3D-visualisering av morfogenes av GFP-uttryckande wing imaginal skivor i<em> Drosophila melanogaster.</em
Abstract
Visualisering utveckla organ bildas liksom progession och behandling av sjukdomen ofta starkt beroende av förmågan att optiskt förhöra molekylära och funktionella förändringar i intakta levande organismer. De flesta befintliga optisk avbildning metoder är otillräckliga för att avbilda på dimensioner som ligger mellan penetration gränserna för modern optisk mikroskopi (0,5-1mm) och spridning-begränsades av optiska macroscopy (> 1 cm) [1]. Därför många viktiga modellorganismer, t.ex. insekter, embryon djur eller små extremiteter djur, förblir otillgängliga för in-vivo optisk avbildning.
Även om det ökar intresset för utveckling av nanometer-upplösning optisk avbildning metoder, har det inte varit många lyckade insatser för att förbättra djupet avbildning penetration. Förmågan att utföra in-vivo imaging bortom mikroskopi gränser är i själva verket träffade svårigheterna med foton spridning som finns i vävnader. De senaste ansträngningarna att bilden hela embryon till exempel [2,3] kräver särskild kemisk behandling av provet, för att rensa dem från spridning, en procedur som gör dem lämpliga endast för post mortem-avbildning. Dessa metoder bevis dock behovet av bildhantering större exemplar än de som vanligen tillåts av två-photon eller konfokalmikroskopi, särskilt i utvecklingsbiologi och i läkemedelsutveckling.
Vi har utvecklat en ny optisk bildteknik som heter Mesoskopisk Fluorescens Tomography [4], som är lämpligt för icke-invasiv in vivo imaging på dimensioner av 1mm-5mm. Metoden börser upplösning för penetrationsdjup, men erbjuder oöverträffad tomografiska avbildning prestanda och det har utvecklats för att lägga till tiden som en ny dimension i utvecklingsbiologi observationer (och eventuellt andra områden i biologisk forskning) genom att förmedla förmågan att bilden utvecklingen av fluorescens- taggade svar över tiden. Som sådan kan påskynda studier av morfologiska eller funktionella beroenden på genmutationer eller yttre stimuli, och kan allt, fånga fullständig bild av utvecklingen eller vävnad funktion genom att låta längsgående tidsförlopp visualisering av samma, utveckla organism.
Tekniken använder en modifierad laboratorium mikroskop och multi-projektion belysning för att samla in data vid 360-graders prognoser. Det gäller Fermi förenkling av Fokker-Plank lösning av fotonen transporter ekvationen, kombinerat med geometrisk optik principer för att bygga upp en realistisk inversion som utformats mesoskopisk sortiment. Detta gör att in-vivo hela kroppen visualisering av icke-transparenta tredimensionella strukturer i prover upp till flera millimeter i storlek.
Vi har visat att in vivo-resultat av tekniken genom att avbilda tredimensionella strukturer för utveckling av Drosophila vävnader in-vivo och genom att följa morfogenes av vingarna i ogenomskinliga Drosophila puppor i realtid över sex timmar i följd.
Protocol
Discussion
In vivo rekonstruktioner av PUPP-fallet och GFP-uttryckande spottkörtlarna av D. melanogaster prepupa (Skala bar, 500 mikron) med motsvarande histologi (blå, Dapi färgning, grönt, GFP fluorescens) visas i figur 1 (ett). Time-lapse serien avbildning av D. melanogaster vinge imaginal skivor visas i Fig.1 (B). Bilderna förvärvas från en enda levande exemplar, vid fyra olika tidpunkter (0,3.0, 3.5, och 6,5 timmar). I den första kolumnen en projektion vid 0 grader med avseende på puppan är ryggens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. Vinegoni erkänner stöd från National Institutes of Health (NIH) bevilja 1-RO1-EB006432.
References
- Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- J, . Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).
