Multicolor Durchflusszytometrie Analysen der zellulären Immunantwort in Rhesusaffen
Summary
Wir demonstrieren den Nutzen des multicolor Durchflusszytometrie für detaillierte phänotypische und funktionelle Charakterisierung von insgesamt sowie Speicherprodukte Teilmengen von CD4 + und CD8 + T-Zellen in Rhesusaffen, das ideale Modell für HIV / AIDS-Impfstoff-Studien.
Abstract
Die Rhesusaffen-Modell ist derzeit das beste verfügbare Modell für HIV-AIDS in Bezug auf das Verständnis der Pathogenese sowie für die Entwicklung von Impfstoffen und Therapeutika<sup> 1,2,3</sup>. Hier beschreiben wir eine Methode für die detaillierte phänotypische und funktionelle Analysen von zellulären Immunantworten, insbesondere intrazelluläre Zytokin-Produktion von CD4 + und CD8 + T-Zellen als auch die individuelle Erinnerung Teilmengen. Wir erhalten präzise quantitative und qualitative Maßnahmen für die Produktion von Interferon-gamma (INF-) und Interleukin (IL) -2 in beiden CD4 + und CD8 + T-Zellen aus dem Rhesusaffen PBMC mit PMA und Ionomycin (PMA + I) stimuliert. Das Zytokin-Profile wurden verschiedene in den verschiedenen Untergruppen von Speicherzellen. Darüber hinaus lieferte dieses Protokoll uns die Empfindlichkeit auch kleinere Fraktionen von Antigen-spezifischen CD4 + demonstrieren und CD8 + T-Zell-Subsets innerhalb der PBMC-Proben von Rhesusaffen mit einer HIV-Envelope-Peptid-Cocktail-Impfstoff in unserem Labor entwickelt immunisiert. Die Multicolor-Durchflusszytometrie-Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um genau zu identifizieren verschiedene Populationen von T-Zellen<sup> 4,5</sup> Mit Zytokin-produzierende Funktion<sup> 6</sup> Folgende unspezifische oder Antigen-spezifische Stimulation<sup> 5,7</sup>.
Protocol
Acknowledgements
Dr. Pramod Nehete und Frau Bharti Nehete für Makaken Blut und PBMC-Proben; Diese Arbeit wurde teilweise durch Mittel aus NIH AI 46969 unterstützt, und alle Zellkulturmedien wurden von der Zentralen Media Laboratory hergestellt, die von NIH CA finanziert wird 16672.
Materials
Solution and Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
- Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
- Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
- Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
- BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)
Activation agents
- Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
- Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
- Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein
Cytokine secretion inhibitors
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)
Antibodies
- Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)
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