Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus
Summary
Demonstramos a utilidade da multicolor citometria de fluxo para caracterização fenotípica e funcional detalhada do total, bem como subconjuntos memória de CD4 + e CD8 + T em macacos rhesus, o modelo ideal para estudos de HIV / AIDS vacina.
Abstract
O modelo de macaco rhesus é atualmente o melhor modelo disponível para o HIV-AIDS com respeito à compreensão da patogênese, bem como para o desenvolvimento de vacinas e terapêutica<sup> 1,2,3</sup>. Aqui, descrevemos um método para a análise detalhada fenotípica e funcional das respostas imunes celulares, especificamente a produção de citocinas intracelulares por células CD4 + e CD8 + T, bem como os subconjuntos de memória individual. Obtivemos precisas medidas quantitativas e qualitativas para a produção de interferon gama (INF-) e interleucina (IL) -2 em ambos os CD4 + e CD8 + T células do PBMC rhesus estimuladas com PMA mais ionomicina (PMA + I). Os perfis das citocinas foram diferentes nos diferentes subgrupos de células de memória. Além disso, este protocolo forneceu-nos a sensibilidade para demonstrar, mesmo frações menores de CD4 antígeno específico + e CD8 + subpopulações de células T dentro do PBMC amostras de macacos rhesus imunizadas com uma vacina contra o HIV cocktail envelope peptídeo desenvolvido em nosso laboratório. O multicolor técnica de citometria de fluxo é uma ferramenta poderosa para identificar precisamente as diferentes populações de células T<sup> 4,5</sup> Com a produção de citocinas, capacidade<sup> 6</sup> Após a estimulação não-específica ou antígeno específico<sup> 5,7</sup>.
Protocol
Acknowledgements
Dr. Pramod Nehete e Sra. Bharti Nehete de sangue e amostras de PBMC macaco; Este trabalho foi parcialmente financiado com recursos do NIH AI 46969 conceder, e todos os meios de cultura de células foram produzidos pelo Laboratório Central de Mídia, que é financiado pelo NIH conceder CA 16672.
Materials
Solution and Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
- Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
- Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
- Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
- BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)
Activation agents
- Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
- Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
- Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein
Cytokine secretion inhibitors
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)
Antibodies
- Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)
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