Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס
Summary
אנו מדגימים את השירות של זרימת cytometry ססגוניות אפיון פנוטיפי ופונקציונלי מפורט הכולל, כמו גם תת זיכרון מסוג CD4 + ו – CD8 + T תאים של קופי רזוס, המודל האידיאלי עבור HIV / איידס מחקרים החיסון.
Abstract
המודל מקוק רזוס היא כיום מודל זמין הטוב ביותר עבור איידס ביחס להבנת הפתוגנזה, כמו גם לפיתוח חיסונים ותרופות<sup> 1,2,3</sup>. כאן אנו מתארים שיטה מנתח פנוטיפי ופונקציונלי מפורט של התגובה החיסונית התאית, ייצור ציטוקינים תאיים במיוחד על ידי CD4 + ו – CD8 + T תאים, כמו גם את תת זיכרון הפרט. השגנו באמצעים כמותיים ואיכותיים מדויק לייצור אינטרפרון גאמא (INF-) ו – interleukin (IL) -2 מסוג CD4 + ו שניהם CD8 + T תאים PBMC מקוק רזוס מגורה עם PMA פלוס ionomycin (PMA + I). פרופילים ציטוקינים היו שונים תת שונים של תאים בזיכרון. יתר על כן, פרוטוקול זה סיפק לנו את הרגישות להפגין אפילו שברים קטנים של אנטיגן ספציפי CD4 + ו – CD8 + T תת תא בתוך דגימות PBMC מ קופי רזוס לחסן עם חיסון פפטידי קוקטייל איידס המעטפה שפותחו במעבדה שלנו. הטכניקה cytometry ססגוניות זרימה הוא כלי רב עוצמה לזהות במדויק אוכלוסיות שונות של תאים T<sup> 4,5</sup> עם יכולת ייצור ציטוקינים<sup> 6</sup> בעקבות הגירוי הלא ספציפית או אנטיגן ספציפי<sup> 5,7</sup>.
Protocol
Acknowledgements
ד"ר פרמוד Nehete וגברת Bharti Nehete דם מקוק דגימות PBMC; עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי כספים NIH מענק AI 46969, וכל תרבות התקשורת התא הופקו על ידי התקשורת המרכזית מעבדה, אשר ממומנת על ידי מענק NIH CA 16672.
Materials
Solution and Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
- Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
- Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
- Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
- BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)
Activation agents
- Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
- Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
- Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein
Cytokine secretion inhibitors
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)
Antibodies
- Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)
References
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
