Multicolor análisis de citometría de flujo de la respuesta inmune celular en macacos rhesus
Summary
Demostrar la utilidad de la citometría de flujo multicolor para la caracterización detallada fenotípica y funcional de la total, así como la memoria subconjuntos de células CD4 + y CD8 + T en macacos rhesus, el modelo ideal para estudios de vacunas contra el VIH / SIDA.
Abstract
El modelo de macaco rhesus es actualmente el mejor modelo disponible para el VIH-SIDA con respecto a la comprensión de la patogénesis, así como para el desarrollo de vacunas y terapias<sup> 1,2,3</sup>. Aquí se describe un método para el análisis detallado fenotípica y funcional de la respuesta inmune celular, específicamente la producción de citoquinas intracelulares de las células CD4 + y CD8 + T, así como los subconjuntos de la memoria individual. Se obtuvieron precisa medidas cuantitativas y cualitativas para la producción de interferón gamma (IFN-) y la interleuquina (IL) -2 en ambos CD4 + y CD8 + T las células de los macacos rhesus PBMC estimuladas con PMA más ionomicina (PMA + I). Los perfiles de citoquinas fueron diferentes en los diferentes subconjuntos de células de memoria. Además, este protocolo nos dio la sensibilidad para demostrar incluso fracciones menores de CD4 + antígeno específico y CD8 + subconjuntos de células T en las muestras de PBMC de macacos rhesus inmunizados con una vacuna contra la envoltura del VIH cóctel péptido desarrollado en nuestro laboratorio. El flujo multicolor técnica de citometría es una poderosa herramienta para identificar con precisión las diferentes poblaciones de células T<sup> 4,5</sup> Con la capacidad de producción de citoquinas<sup> 6</sup> Después de la estimulación no específica o antígeno-específicas<sup> 5,7</sup>.
Protocol
Acknowledgements
Dr. Pramod Nehete y la señora Bharti Nehete de sangre y muestras de PBMC macacos; Este trabajo fue financiado parcialmente con fondos del NIH AI 46969, y todos los medios de cultivo celular fueron producidos por el Laboratorio Central de los medios de comunicación, que es financiado por el NIH subvención CA 16672.
Materials
Solution and Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
- Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
- Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
- Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
- BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)
Activation agents
- Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
- Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
- Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein
Cytokine secretion inhibitors
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)
Antibodies
- Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)
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