Multicolor flödescytometrisystem Analyser av cellulära immunförsvaret i Rhesus makaker
Summary
Vi visar nyttan av multicolor flödescytometri för detaljerad fenotypisk och funktionell karakterisering av den totala såväl som delmängder minne av CD4 + och CD8 + T-celler i rhesus makaker, den ideala modellen för hiv / aids-vaccin studier.
Abstract
Den rhesus makak-modellen är för närvarande det bästa tillgängliga modellen för hiv-aids vad gäller ökad förståelse för uppkomsten och utvecklingen av vaccin och läkemedel<sup> 1,2,3</sup>. Här beskriver vi en metod för detaljerad fenotypisk och funktionella analyser av cellulära immunsvaret, särskilt intracellulär cytokin produktion av CD4 + och CD8 + T-celler såväl som enskilda delmängder minne. Vi fick exakta kvantitativa och kvalitativa åtgärder för produktion av interferon-gamma (INF-) och interleukin (IL) -2 i både CD4 + och CD8 + T celler från rhesus makak PBMC stimuleras med PMA plus ionomycin (PMA + I). Den cytokin profilerna var olika i de olika undergrupper av minnesceller. Dessutom, under förutsättning att detta protokoll oss känslighet för att påvisa även små fraktioner av antigen CD4 + och CD8 + T celler undergrupper inom PBMC prover från rhesus makaker immuniserade med en hiv-kuvert peptid cocktail vaccin som utvecklats i vårt laboratorium. Den multicolor flödescytometri teknik är ett kraftfullt verktyg för att exakt identifiera olika populationer av T-celler<sup> 4,5</sup> Med cytokin-producerande förmåga<sup> 6</sup> Följande icke-specifik eller antigenspecifika stimulering<sup> 5,7</sup>.
Protocol
Acknowledgements
Dr Pramod Nehete och fru Bharti Nehete för makak blod och PBMC prover, Detta arbete har delvis stöd av medel från NIH bidrag AI 46.969, och alla cellodling media producerades av Central Media Laboratory, som finansieras av NIH bidrag CA 16.672.
Materials
Solution and Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
- Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
- Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
- Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
- BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)
Activation agents
- Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
- Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
- Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein
Cytokine secretion inhibitors
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)
Antibodies
- Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)
References
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
