पक्षपाती और गैर पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं की स्वस्थानी Subcellular Fractionation
Summary
खुर्दबीन coverslips पर स्तनधारी कोशिकाओं की स्वस्थानी subcellular fractionation में प्रोटीन स्थानीयकरण के दृश्य की अनुमति देता है.
Abstract
प्रोटीन समारोह परिचित प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए युग्मित है. हालांकि कुछ प्रोटीन एक विशिष्ट स्थान या subcellular डिब्बे के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं, कई प्रोटीन एक उप जनसंख्या है कि कसकर एक विशेष subcellular डोमेन या संरचना के साथ जुड़ा हुआ है के साथ एक मुक्त विदेशी मुद्रा में स्वतंत्र रूप से diffusing जनसंख्या के रूप में मौजूद हैं. सीटू subcellular fractionation में के दृश्य की अनुमति देता है प्रोटीन compartmentalization और भी उप आबादी है कि विशिष्ट संरचनाओं के लिए स्थानीयकरण प्रोटीन प्रकट कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, घुलनशील cytoplasmic प्रोटीन और शिथिल आयोजित परमाणु प्रोटीन को हटाने chromatin के साथ कुछ प्रतिलेखन कारकों के स्थिर सहयोग प्रकट कर सकते हैं. डीएनए के बाद पाचन कुछ मामलों में प्रोटीन और RNAs कि सामूहिक रूप से परमाणु पाड़ या परमाणु मैट्रिक्स कहा जाता है के नेटवर्क के साथ सहयोग कर सकते हैं प्रकट.
यहाँ हम खुर्दबीन coverslips पर पक्षपाती और गैर पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं के स्वस्थानी fractionation के दौरान आवश्यक कदम का वर्णन करता है. प्रोटीन दृश्य विशिष्ट एंटीबॉडी या फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है है. एंटीबॉडी और / या फ्लोरोसेंट रंजक है कि विशिष्ट डिब्बों या संरचनाओं के लिए मार्कर के रूप में में कार्य प्रोटीन स्थानीयकरण विस्तार में मैप करने के लिए अनुमति देते हैं सीटू fractionation में भी पश्चिमी करने के लिए प्रत्येक अंश में मौजूद प्रोटीन की मात्रा की तुलना सोख्ता के साथ संयुक्त किया जा सकता है.. यह सरल जैव रासायनिक दृष्टिकोण संघों है कि अन्यथा नहीं चल पाता रहेगा प्रकट कर सकते हैं.
Protocol
Discussion
आम समस्याओं और सुझावों:
सभी या कक्षों की सबसे धोने के दौरान खो रहे हैं. धोने चरणों के दौरान तरल पदार्थ 6 अच्छी तरह से थाली coverslip परहेज के पक्ष में धीरे जोडी चाहिए. इसी तरह तरल पदार्थ सावधानी झुकाव ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anyaporn Sawasdichai और Nazefah अब्दुल हमीद रायल थाई सरकार और मलेशिया सरकार के लिए आभारी क्रमशः पीएच.डी. के लिए छात्रवृत्ति. यह काम एक वेलकम ट्रस्ट परियोजना PSJ और केजी के लिए सम्मानित किया अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम भी हैं के ब्रिस्टल वोल्फसन Bioimaging सुविधा के विश्वविद्यालय के लिए आभारी हैं.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |
References
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription. J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).
- Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins. Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).
- McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1. J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).
- McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking. J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).
- Melan, M. A., Sluder, G. Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy. J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).
- Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association. J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).
