, Memeli hücrelerinin mikroskop lamelleri yerinde Subselüler fraksiyonasyon protein localisation görselleştirme sağlar .
Protein fonksiyonu yakından protein lokalizasyonuna birleştirilmiştir. Yerinde Subselüler fraksiyonasyon bazı proteinler belirli bir konuma veya hücre içi bölmesi ile sınırlı olmasına rağmen, birçok protein, belirli bir Subselüler etki alanı veya yapısı ile sıkı sıkıya ilişkili bir alt nüfusa sahip, serbest döviz serbestçe difüzyon nüfus olarak mevcuttur. görselleştirme sağlar protein bölümlendirme ve aynı zamanda protein belirli yapılara lokalize alt-topluluklarda ortaya çıkarabilir. Örneğin, çözünür sitoplazmik proteinleri ve gevşek tutulan nükleer proteinlerin çıkarılması kromatin ile bazı transkripsiyon faktörleri istikrarlı bir ilişki ortaya çıkarabilir. DNA sonraki sindirim topluca nükleer iskele veya nükleer matriks denir protein ve RNA ağı ile birlikte, bazı durumlarda ortaya çıkarabilir.
Burada, yapışık ve yapışmaz memeli hücrelerinin mikroskop lamelleri yerinde fraksiyonasyon sırasında gerekli adımları açıklar . Protein görselleştirme spesifik antikorların ya da floresan füzyon proteinleri ve floresan mikroskopi kullanılarak elde edilebilir. Antikorlar ve / veya özel bölme ya da yapılar için belirteç olarak hareket floresan boyalar protein yerelleştirme ayrıntılı olarak eşlenen izin yerinde fraksiyonasyon da batı her fraksiyon protein miktarları karşılaştırmak için blot ile kombine edilebilir. Bu basit biyokimyasal yaklaşım, aksi tespit edilmemiş kalacaktı dernekler ortaya çıkarabilir.
Yaygın sorunlar ve öneriler:
Hücrelerin tamamı ya da bir çoğunu yıkama sırasında kaybolur. Yıkama adımları sırasında sıvı lamel kaçınarak 6 plaka yan yavaş yavaş ilave edilmelidir. Benzer şekilde, dikkatli bir şekilde devirme levha ile sıvı kaldırıldı olmalıdır ve aşırı sıvı yavaş yavaş pipetleme. Hücre adezyon poli-L-Lizin kaplı lamelleri kullanarak artırılabilir.
Genomik DNA'nın tamamen sindirilmiş değildir. Bazı hü…
The authors have nothing to disclose.
Anyaporn Sawasdichai ve Nazefah Abdülhamit'in doktora sırasıyla Kraliyet Tayland Hükümeti ve Malezya Hükümeti minnettarız Burslar. Bu çalışma, Wellcome Trust PSJ ve KG için verilen bir proje hibe tarafından finanse edildi. Ayrıca, Bristol Wolfson bio Tesisi Üniversitesi minnettarız.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
Trypsin | Chemical | |||
EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |