En Fraccionamiento subcelular situ de células mamíferas adherentes y no adherentes-
Summary
En el fraccionamiento subcelular situ de células de mamíferos en cubreobjetos microscopio permite la visualización de la localización de la proteína.
Abstract
Función de la proteína está íntimamente unido a la localización de la proteína. A pesar de algunas proteínas se limitan a una ubicación específica o compartimento subcelular, muchas proteínas están presentes en una población libre difusión de libre cambio con una sub-población que está estrechamente asociada a un dominio particular o de la estructura subcelular. En fraccionamiento subcelular situ permite la visualización de proteína de la compartimentación y también puede revelar proteína sub-poblaciones que se localizan en las estructuras específicas. Por ejemplo, la eliminación de proteínas solubles citoplásmicos y suelto y sujeto proteínas nucleares puede revelar la asociación estable de algunos factores de transcripción con la cromatina. La digestión posterior de ADN en algunos casos pueden revelar asociación con la red de proteínas y ARN que se denominan colectivamente la nuclear andamio o matriz nuclear.
A continuación se describen los pasos necesarios en el fraccionamiento de las células de mamíferos in situ de adherentes y no adherentes en cubreobjetos microscopio. Visualización de la proteína se puede lograr utilizando anticuerpos específicos o proteínas fluorescentes de fusión y microscopía de fluorescencia. Los anticuerpos y / o tintes fluorescentes que actúan como marcadores para los compartimientos o estructuras específicas permiten la localización de proteínas para ser cartografiado con detalle. En el fraccionamiento situ también se puede combinar con el Western Blot para comparar la cantidad de proteínas presentes en cada fracción. Este enfoque bioquímico simple puede revelar asociaciones que de otra manera no se detectan.
Protocol
Discussion
Los problemas más comunes y sugerencias:
Todos o la mayoría de las células se pierden durante el lavado. Durante los pasos de líquidos de limpieza debe realizarse lentamente hacia el lado de la placa de 6 pocillos evitando el cubreobjetos. Del mismo modo los líquidos deben ser removidos cuidadosamente inclinando la placa y lentamente pipetear el exceso de líquido. Adhesión celular se puede aumentar el uso de poli-L-lisina cubreobjetos recubiertos.
ADN genómi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anyaporn Sawasdichai y Nazefah Abdul Hamid muy agradecidos con el Gobierno Real de Tailandia y el Gobierno de Malasia, respectivamente, para doctorado Becas. Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust proyecto de subvención concedida a PSJ y KG. También estamos agradecidos a la Universidad de Bristol Fondo Bioimagen Wolfson.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |
References
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription. J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).
- Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins. Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).
- McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1. J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).
- McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking. J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).
- Melan, M. A., Sluder, G. Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy. J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).
- Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association. J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).
