Fracionamento em Subcelulares situ de aderentes e não aderentes células de mamíferos
Summary
No fracionamento subcelular situ de células de mamíferos em lamínulas de microscópio permite a visualização de localização de proteínas.
Abstract
Função da proteína está intimamente acoplado a localização de proteínas. Apesar de algumas proteínas são restritos a um local específico ou compartimento subcelular, muitas proteínas estão presentes como uma população livre difusão de livre troca com uma sub-população que está fortemente associado a um domínio particular subcelular ou estrutura. Fracionamento subcelular Em situ permite a visualização de compartimentalização de proteína e pode também revelar proteína sub-populações que localizar a estruturas específicas. Por exemplo, a remoção de proteínas solúveis citoplasmáticas e vagamente realizada proteínas nucleares pode revelar a associação estável de alguns fatores de transcrição com cromatina. Digestão subseqüente de DNA pode, em alguns casos revelar associação com a rede de proteínas e RNAs que é coletivamente chamado de andaime nuclear ou matriz nuclear.
Aqui nós descrevemos os passos necessários durante o fracionamento em situ de aderentes e não aderentes células de mamíferos em lamínulas de microscópio. Visualização de proteínas pode ser conseguido usando anticorpos específicos ou proteínas de fusão fluorescentes e microscopia de fluorescência. Anticorpos e / ou corantes fluorescentes que funcionam como marcadores para compartimentos específicos ou estruturas permitem localização de proteínas a ser mapeada em detalhes. No fracionamento situ também pode ser combinado com western blotting para comparar as quantidades de proteínas presentes em cada fração. Esta abordagem simples bioquímicos podem revelar associações que poderiam passar despercebido.
Protocol
Discussion
Problemas comuns e sugestões:
Todos ou a maioria das células são perdidas durante a lavagem. Durante as etapas de líquidos de lavagem deve ser adicionado lentamente para o lado do prato 6-bem evitando a lamela. Da mesma forma os líquidos devem ser retirados com cuidado a placa de inclinação e, lentamente, pipetagem off excesso de líquido. Adesão celular pode ser aumentada usando poli-L-Lisina lamínulas revestido.
DNA genômico não é completamente digerid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anyaporn Sawasdichai e Nazefah Abdul Hamid são gratos ao Governo Real da Tailândia e do Governo da Malásia, respectivamente, para doutorado Bolsas de estudo. Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust um projeto de subvenção concedida ao PSJ e KG. Agradecemos também à Universidade de Bristol Facility BioImaging Wolfson.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |
References
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