В месте субклеточных фракционирования клеток млекопитающих на микроскопе покровные позволяет визуализировать белки локализации.
Белки функции тесно связаны с белком локализации. Хотя некоторые белки ограничены в определенном месте или субклеточных отсек, многие белки присутствуют в виде свободно диффундирующих населения в свободном обмене с подгруппы населения, тесно связанный с определенным субклеточных домена или структуры. Натурные субклеточного фракционирования позволяет визуализировать компартментализация белка, а также может выявить белок подгруппах, локализовать к конкретным структурам. Например, удаление растворимых цитоплазматических белков и слабозакрепленных ядерных белков может выявить устойчивые ассоциации некоторых факторов транскрипции с хроматином. Последующие переваривания ДНК может в некоторых случаях выявить связь с сетью белков и РНК, является общее название ядерной эшафот или ядерного матрикса.
Здесь мы опишем шаги, необходимые во время на месте фракционирования сторонник и не сторонник клетках млекопитающих на микроскопе покровные. Белки визуализации можно достичь с помощью специфических антител или флуоресцентных белков слияния и флуоресцентной микроскопии. Антитела и / или флуоресцентными красителями, которые выступают в качестве маркеров для конкретного отделения или структуры позволяют белка локализации быть отображены в деталях. Натурные фракционирования также может быть объединена с западной промокательной сравнить количество белков, присутствующих в каждой фракции. Этот простой биохимический подход может выявить ассоциации, которые могли бы остаться незамеченными.
Общие проблемы и предложения:
Все или большинство из клетки потеряли во время стирки. Во время промывки жидкости должны быть медленно добавляют в сторону 6-луночный планшет избегая покровное. Аналогично жидкостей должны быть удалены путем тщательного наклоняя тарелку и ?…
The authors have nothing to disclose.
Anyaporn Sawasdichai и Nazefah Абдул Хамид благодарны правительству Королевства Таиланд и правительством Малайзии, соответственно, для доктор философии Стипендии. Эта работа финансировалась Wellcome Trust грант присужден PSJ и KG. Мы также благодарны Бристольского университета фонда Bioimaging Вольфсон.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
Trypsin | Chemical | |||
EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |