التوسيم وخلايا الدماغ المؤخر التصوير في اسماك الزرد
Summary
المفتاح لفهم العمليات التي تشكل تخلقية الجنين في وقت مبكر هو القدرة على الخلايا في صورة عالية الدقة. نحن هنا وصف تقنية لوضع العلامات خلايا مفردة أو مجموعات صغيرة من الخلايا في الأجنة الزرد كله مع غشاء استهداف بروتين الفلورية الخضراء.
Abstract
المفتاح لفهم العمليات التي تشكل تخلقية الجنين في وقت مبكر الفقاريات هي القدرة على الخلايا في صورة عالية الدقة. في الأجنة الزرد ، وحقن من نتائج فحص الحمض النووي البلازميد الفسيفساء في التعبير ، والسماح لتصور واحد من الخلايا أو مجموعات صغيرة من الخلايا<sup> 1</sup>. نحن تصف كيف يمكن استخدام حقن الحمض النووي بلازميد ترميز غشاء استهداف بروتين الفلورية الخضراء (mGFP) الخاضعة لسيطرة أحد المروجين للخلايا في كل مكان التصوير تمر neurulation. مركزية لهذا البروتوكول هي المنهجية للخلايا المسمى التصوير بدقة عالية في الفرعين ، وكذلك في الوقت الحقيقي. هذا البروتوكول ينطوي على حقن الحمض النووي في mGFP الأجنة الزرد الشباب. ثم تتم معالجة الأجنة لsectioning vibratome ، ووضع العلامات الأضداد والتصوير مع المجهر مبائر. بدلا من ذلك ، يمكن تصوير الأجنة الحية mGFP معربا عن استخدام الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر. لقد اعتدنا في السابق مباشرة لهذا النهج تحليل السلوكيات التي تدفع الخلايا العصبية تشكيل الأنبوب في منطقة الدماغ المؤخر الأجنة الزرد<sup> 2</sup>. الاستعدادات الثابتة يسمح لرؤية غير مسبوقة من الأشكال وتنظيم الخلايا في الأنبوب العصبي في حين يعيش التصوير استكمال هذا النهج تمكن من فهم أفضل للديناميات الخلوية التي تحدث أثناء neurulation.
Protocol
Discussion
في الختام ، وصفت تقنيات الوسم هنا يسمح للتحليل خلية واحدة من عمليات التخلق في الجنين الزرد. التركيز الأساسي لهذا البروتوكول هو على أساليب التصوير للخلايا المسمى في الأنبوب العصبي باستخدام mGFP تحت سيطرة أحد المروجين في كل مكان. وينبغي للتطبيقات إضافية من هذا التعبير ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق منحة المعاهد الوطنية للصحة التي منحت لبروستر R. (1R01GM085290 – 01A1).
Materials
Solutions
- Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O
- Hank’s Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O
- Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
- Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O
- 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
- Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish Practical approach series. , (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
