Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Summary

Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.

Abstract

Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die die frühen Wirbeltierembryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. In Zebrafisch-Embryos, Injektion von Plasmid-DNA führt zu Mosaik-Ausdruck, so dass für die Visualisierung von einzelnen Zellen oder kleine Gruppen von Zellen¹. Wir beschreiben, wie Injektion von Plasmid-DNA, die Membran-bezogene Green Fluorescent Protein (mGFP) unter der Kontrolle eines ubiquitären Promotor für Imaging-Zellen, die eine Neurulation eingesetzt werden kann. Im Mittelpunkt dieses Protokolls ist die Methode für die Bildgebung markierten Zellen mit hoher Auflösung in Abschnitte und auch in Echtzeit. Das Protokoll beinhaltet die Injektion von DNA in mGFP junge Zebrabärblinge. Die Embryonen werden dann für Vibratom Schneiden, Antikörpermarkierung und Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop verarbeitet. Alternativ können lebende Embryonen zum Ausdruck mGFP aufgenommen mit Zeitraffer-konfokalen Mikroskopie werden. Wir haben früher dieser naive Ansatz verwendet, um die zelluläre Verhaltensweisen, Neuralrohr Bildung Laufwerk im Hinterhirn Region Zebrafischembryonen analysieren². Die feste Vorbereitungen für beispiellose Visualisierung von Zellformen und Organisation in das Neuralrohr erlaubt während der Live-Bildgebung dieser Ansatz ermöglicht ein besseres Verständnis der zellulären Dynamik, die während Neurulation ergänzt.

Protocol

1.Microinjection Verdünnen Plasmid kodiert Membran gezielte Green Fluorescent Protein (mGFP, mit freundlicher Genehmigung von Richard Harland) zu einer Konzentration von 40 ng / ml. DNA wird durch Linearisierung Plasmid (mGFP/PCS2 +, mit freundlicher Genehmigung von Richard Harland) unter Verwendung des Qiagen Maxi Prep Kit vorbereitet. Die Zugabe von Phenolrot (verwässert 1 / 10 Volumen), um die Lösung bevorzugt, die Lösung zu visualisieren. Keep DNA-Lösung auf Eis. Unter einem Stereomikroskop…

Discussion

Abschließend beschrieb die Kennzeichnung Techniken hier erlauben einzelne Zelle Analyse von morphogenetischen Prozesse im Zebrafisch Embryo. Der primäre Schwerpunkt dieses Protokoll wird auf Methoden zur Darstellung von markierten Zellen in das Neuralrohr mit mGFP unter der Kontrolle eines ubiquitären Promoters. Weitere Anwendungen dieser transiente Expression Assays sollte sich der Leser zu einer neueren Arbeit von Andersen et al verweisen. ^3.

Materials

Solutions

• Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H₂O
• Hank’s Stock #2: 0.358 g Na₂HPO₄ Anhydrous, 0.60 g KH₂PO₄ in 100 ml ddH₂O
• Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl₂ in 50 ml ddH₂O
• Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO₄x7H₂O in 50 ml dd H₂O
• 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
• Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)