Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

Summary

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Abstract

초기 척추의 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. zebrafish 배아, 모자이크 표현의 플라스미드 DNA 결과의 주입이 단일 세포 또는 세포의 작은 클러스터의 시각화에 대한 허용에¹. 우리는 유비 쿼터스 모터의 제어하에 플라스미드 DNA 인코딩 막 타겟 그린 형광 단백질 (mGFP)의 분사가 neurulation를 겪고 이미징 세포에 사용할 수있는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에 센트럴 섹션에 있으며, 실시간으로 고해상도의 영상 표시 세포에 대한 방법론이다. 이 프로토콜은 젊은 zebrafish의 배아에 mGFP의 DNA의 삽입을 알아볼 수 있습니다. 배아는 다음 vibratome sectioning, 항체 라벨과 공촛점 현미경으로 영상에 대한 처리됩니다. 또는 mGFP을 표현 라이브 배아는 시간이 경과 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 우리는 이전에 zebrafish 배아의 hindbrain 지역에서 신경 튜브 형성을 유발 세포 행동을 분석하는이 간단한 접근 방법을 사용했을². 라이브 영상은 neurulation 동안을 세포 역학의 이해를 가능하게이 방법을 보완하면서 고정 준비가 세포 모양과 신경 튜브 조직의 전례 시각화를위한있었습니다.

Protocol

1.Microinjection 희석 플라스미드 인코딩 막 타겟 그린 형광 단백질 (mGFP, 리차드 할랜드의 호의) 40 NG / ML의 농도. DNA는 Qiagen의 맥시 준비 키트를 사용하여 정화 플라스미드 (리차드 할랜드의 mGFP/PCS2 +, 호의)를 linearizing으로 준비가되어 있습니다. 솔루션에 페놀 레드 (10분의 1 총 볼륨을 희석)의 추가는 솔루션을 시각화하는 것이 좋습니다. 얼음 DNA 솔루션을 유지. 졸업 슬라이드에 바늘?…

Discussion

결론적으로, 분류 기술은 zebrafish 배아에 morphogenetic 프로세스의 단일 세포 분석을위한 수 있도록 여기에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 주요 강조는 유비 쿼터스 모터의 제어하에 mGFP을 사용하여 신경 튜브의 영상 표시 전지 방식에 있습니다. 이 과도 표현 분석 독자의 추가 어플 리케이션을위한 안데르센 외의 최근 논문을 참조해야합니다. ^3.

Materials

Solutions

• Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H₂O
• Hank’s Stock #2: 0.358 g Na₂HPO₄ Anhydrous, 0.60 g KH₂PO₄ in 100 ml ddH₂O
• Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl₂ in 50 ml ddH₂O
• Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO₄x7H₂O in 50 ml dd H₂O
• 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
• Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)