Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri
Summary
Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.
Abstract
Anahtar erken omurgalı embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamak için yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Zebra balığı embriyosu, enjeksiyon, mozaik ifade plazmid DNA sonuçlarının tek hücreler veya küçük hücre kümeleri görünüm için izin<sup> 1</sup>. Biz her yerde bir organizatörü kontrol altında plazmid DNA kodlaması membran hedefli Yeşil Floresan Protein (mGFP) enjeksiyon, neurulation geçiren görüntüleme hücreleri için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Bu protokol Orta bölümleri ve aynı zamanda gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlükte görüntüleme etiketli hücreleri için metodoloji. Bu protokol, genç zebrafish embriyolara mGFP DNA enjeksiyon gerektirir. Embriyolar sonra vibratome kesit, antikor konfokal mikroskop ile etiketleme ve görüntüleme için işlenir. Alternatif olarak, mGFP ifade canlı embriyolarının zaman atlamalı konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenebilir. Biz daha önce nöral tüp oluşumu zebrafish embriyoların Beyin bölgedeki hücresel sürücü davranışlarını analiz etmek için bu basit yaklaşım kullanıldı.<sup> 2</sup>. Canlı görüntüleme neurulation sırasında yer alan hücresel dinamiklerinin daha iyi anlaşılmasını sağlayan bu yaklaşım ise sabit hazırlıklar tamamlanır hücre şekil ve nöral tüp organizasyon daha önce benzeri görülmemiş bir görünüm için izin verdi.
Protocol
Discussion
Sonuç olarak, etiketleme teknikleri zebrafish embriyo morfogenetik süreçleri tek bir hücre analizi için izin olarak tanımlanmıştır. Bu protokolün temel vurgu nöral tüp kontrolü altındaki her yerde bir organizatörü mGFP kullanarak görüntüleme etiketli hücreleri için yöntemler. Andersen ve arkadaşları tarafından yeni bir kağıt bu geçici ifade test okuyucuların ek uygulamalar için başvurmalıdır. 3.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, R. Brewster (1R01GM085290-01A1) verilen bir NIH hibe ile desteklendi.
Materials
Solutions
- Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O
- Hank’s Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O
- Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
- Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O
- 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
- Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish Practical approach series. , (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
