Summary
Protokol, örnek olarak osteosarkom fare modelinde Yiqi Jiedu kaynatma ile kaynatma formülü ve gavaj tekniğinin ayrıntılı bir standardizasyon sürecini sağlar. Hayvanların korunmasını açıklar ve araştırma verilerinin güvenilirliğini artırır, in vivo kaynatma formüllerinin terapötik etkinliğini ve moleküler mekanizmalarını araştırmak için etkili stratejiler sağlar.
Abstract
Kaynatma formülü, geleneksel Çin tıbbında en sık kullanılan dozaj şeklidir ve hastaların spesifik sendromlarına göre hızlı etki, kolay emilim ve bireyselleştirilmiş tedavi ile karakterize edilen trans-oral uygulama ile binlerce yıldır klinik uygulamada uygulanmaktadır. Kaynatma formülünün kalitesi, geleneksel Çin tıbbının klinik etkinliğinden doğrudan sorumludur; Bu nedenle, kaynatma formülünün standardizasyon süreci, öznel faktörlerin neden olduğu kaynatma kalitesindeki farklılıkları önlemek için önemlidir. Bu arada, klinik deneylerin yapılmasının sınırlamaları nedeniyle, fareler gibi insan hastalıkları taşıyan küçük hayvanlar, geleneksel Çin tıbbı için kaynatma formülü de dahil olmak üzere farklı müdahalelerin terapötik etkinliğini ve kapsamlı mekanizmalarını araştırmak için tıbbi araştırmalarda sıklıkla kullanılmaktadır. Sonuç olarak, önemli bir trans-oral uygulama yöntemi olarak, yetenekli gavaj tekniği, her model hayvana eşit miktarda ilaç uygulanmasını sağlayacak ve doğru deneysel sonuçlara yol açacak potansiyel yemek borusu hasarını ve ilaç dökülmesini önlemek için özellikle önemlidir. Ayrıca, hayvan refahını korumak ve kullanılan hayvan sayısını en aza indirmek için standartlaştırılmış kaynatma formülü hazırlama yöntemi ve vasıflı gavaj stratejisi gereklidir. Burada, örnek olarak osteosarkom fare modelinde Yiqi Jiedu kaynatma ile kaynatma formülü ve gavaj tekniğinin ayrıntılı bir standardizasyon sürecini bildirdik. Etkinlik, tümör hacmine göre değerlendirildi. Bu protokol, hayvanların korunmasını en üst düzeye çıkaracak ve araştırma verilerinin güvenilirliğini artıracak, bu nedenle in vivo olarak geleneksel Çin tıbbı için kaynatma formülünün terapötik etkinliğini ve moleküler mekanizmalarını araştırmak için etkili stratejiler sağlayacaktır.
Introduction
Kaynatma formülü, geleneksel Çin tıbbının ve sıvı tıbbi ilaçlarınen yaygın kullanılan dozaj şeklidir 1,2. Geleneksel Çin tıbbının kaynatma formülü, otların ıslatıldıktan sonra suda kaynatılması ve ardından tortuların atılması için süzülmesiyle işlenir.
Kaynatma formülü, özellikle geleneksel Çin tıbbında kanıta dayalı tedavinin özelliklerine uygun olarak, klinik gerekliliklere göre kişiselleştirilebildiğinden, trans-oral uygulama yoluyla bu dozaj formu, spesifik ve yeri doldurulamaz avantajlarla binlerce yıldır klinik uygulamada uygulanmaktadır 3,4. Kaynatma formülünün kalitesi doğrudan klinik etkinlik ile ilgilidir. Bu nedenle, kaynatma formülü, aktif bileşenlerin maksimum düzeyde ekstrakte edilmesini ve korunmasını sağlamak için standartlaştırılmış kaynatma yöntemlerinin ilkelerine göre hazırlanmalıdır3. Bu arada, kaynatmaya hazır ilaçlar, klinik uygulamada kullanılan çiğ Çin bitkilerinin ana şeklidir; Reçete edilen kaynatmaya hazır ilaçların kalite standartları ve üretim yöntemleri Çin Farmakopesi2 hükümlerine uygun olmalıdır. Ayrıca, reçete edilen kaynatmaya hazır ilaçlar, özel bir ilaç kabında ısıtılarak kaynatılmadan önce en az 30 dakika soğuk içme suyuna batırılmalıdır5. Çalışmalar, aktif bileşenlerin çoğunun iki kez kaynatma yoluyla ekstrakte edilebileceğini göstermiştir ve Tıbbi Kurumlarda Geleneksel Çin İlaçlarının Kaynatma Odalarının İdaresi için Uygulama Kuralları da kaynatma işleminin iki kez yapılmasını öngörmektedir 4,6,7. Sert dokulu veya tonikli olanlar gibi özel Çin otları reçete edilirse, kaynatma süresinin uzatılması önerilir. Reçete edilen kaynatmaya hazır ilaçların ıslatıldığı kaptan başlayarak, kaynatma formülü ile doğrudan temas eden kaynatma kapları ve saklama kapları, kimyasal olarak stabil olmalı ve güveç, seramik, cam ve paslanmaz çelik gibi kapaklara sahip olmalıdır. Bununla birlikte, alüminyum ve sıradan plastik ürünler kullanılmamalı, terapötik etkinliği azaltacak ve hatta zararlı etkiler yaratacak olası kimyasal reaksiyonlardan kaçınmak için demir ve diğer aşındırıcı kaplar yasaklanmalıdır 4,6,7.
Klinik deneylerin yapılmasının sınırlamaları nedeniyle, fareler gibi insan hastalıklarını taşıyan küçük hayvanlar, geleneksel Çin tıbbının kaynatma formülü de dahil olmak üzere farklı müdahalelerin terapötik etkinliğini ve kapsamlı mekanizmalarını araştırmak için tıbbi araştırmalarda sıklıkla kullanılır 8,9; Bununla birlikte, insanlardan farklı olarak, kaynatma formülleri her gün hazırlanmalı, birlikte karıştırılmalı ve klinik uygulamada günde 2 kez taze olarak uygulanmalıdır. Hayvanlar, ilaçlarını gerekli dozajla zamanında gönüllü olarak alamazlar ve geleneksel Çin tıbbı ile ilgili hayvan deneylerinin çoğu, şu anda kaynatma formüllerinin gavaj bazlı oral uygulamasıdır. İn vivo hayvan deneyleri için kullanılan kaynatma formülleri önceden hazırlanmalı, aliquoted'lanmalı, -20 °C'de saklanmalı ve kullanımdan hemen önce çözülmelidir 3,4,10. Ayrıca, standart altı hayvan immobilizasyonu ve gavaj iğnesi manipülasyonu, gereksiz yaralanma ve olumsuz duygu riskini artırır. Bu nedenle, trans-oral ilaç dağıtımının önemli bir yöntemi olarak, yetenekli gavaj tekniği, olası özofagus yaralanmasını ve ilaç dökülmesini önlemek için özellikle önemlidir, böylece her model hayvanın doğru deneysel sonuçlar elde etmek için eşit miktarda reçeteli bitkisel ilaç almasını sağlar. Burada, geleneksel Çin tıbbının kaynatma formülü için bir gavaj protokolü sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, örnek olarak Yiqi Jiedu kaynatma kullanılarak osteosarkom model farelerde ayrıntılı gavaj tekniğini açıklar. Bu deneyde dört haftalık erkek atletik fareler (BALB / c çıplak) kullanıldı ve Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nin SPF dereceli üreme odasında tutuldu. Tüm hayvan deneyleri, Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Yönetimi ve Komitesi tarafından onaylanmış, Laboratuvar Hayvanları için Etik Kurallarına (Hayvan Etiği Onay Numarası: PZSHUTCM2304060007) uyulmuş ve laboratuvar hayvanlarıyla ilgili uluslararası gerekliliklere sıkı sıkıya bağlı kalınarak yürütülmüştür.
1. Malzemeler
- Aşağıdaki malzemeleri elde edin: Çin otları (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52.5 g, Dikenli takke otu 31.5 g), 1 mL şırınga ve 12G / 55 mm dirsek gavaj iğnesi (Şekil 1).
2. Dozaj tayini
- Günlük dozu şu şekilde hesaplayın: standart vücut ağırlığı 60 kg olan yetişkinler için günlük doz Ginseng 12 g, Hedyotis diffusa 15 g ve Dikenli takke otu 9 g, toplam 36 g kaynatma hazır ilaç, yani 0.6 g kaynatmaya hazır ilaçlar / kg vücut ağırlığı. Vücut yüzey alanına göre standart vücut ağırlığı 60 kg olan yetişkinler ile standart vücut ağırlığı 25 g olan fareler arasında eşdeğer doz için 12 kez, düşük doz için 6 kez ve yüksek doz için 24 kez atıfta bulunarak11 ve ön verilerimiz, mevcut çalışmada fareler için 20 kat doz oranı Yiqi Jiedu kaynatma kullanın, Bu nedenle, fareler için dozaj 12 g kaynatmaya hazır ilaçlar / kg vücut ağırlığı idi.
- Denklemi kullanarak her fare için dozu hesaplayın:
Fare için dozaj (stand vücut ağırlığı) = yetişkin için dozaj (stand vücut ağırlığı) x 20 (belirlenmiş eşdeğer doz oranı).
Her farenin günlük dozu, 200 μL'de 0.3 g [(12 g kaynatmaya hazır ilaçlar / 1000 g vücut ağırlığı) x 25 g vücut ağırlığı] ve nihai konsantrasyon 1.5 g / mL'dir. - Yiqi Jiedu kaynatma grubundaki fareler (n = 7) için 28 gün boyunca gavaj uygulaması ile toplam kaynatmaya hazır ilaçları 58.8 g olacak şekilde hesaplayın. 1,5 g/mL'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için bunu 39,2 mL'ye konsantre edin.
- Kaynatma ve gavaj aşamaları sırasında olası ilaç kaybını göz önünde bulundurarak ve hesaplama kolaylığı için, toplam 126 g (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52.5 g, Dikenli takke bitkisi 31.5 g) kaynatmaya hazır ilaç hazırlayın, 84 mL'lik bir son hacme konsantre edin.
3. Hücre kaynağı ve kültürü
- ATCC hücre bankasından insan kaynaklı 143B osteosarkom hücreleri satın alın.
- 10 cm'lik bir hücre kültürü kabında% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin içeren 10 mL MEM ortamında 1 x 106 143B hücrelerini tohumlayın.
- Hücreler% 80 -% 90 birleşene kadar% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 143B hücrelerini kültürleyin.
4. Modelleme yöntemleri
- % 80 birleşik kültürlenmiş 143B hücrelerini toplayın, 6 mL% 10 serum içeren MEM ortamına yeniden süspanse edin ve 1 x 107 hücre / mL nihai konsantrasyona sahip bir hücre süspansiyonu yapmak için 1: 1 hacim oranında bazal membran matris jeli ile karıştırın.
- Önceki yayınımız 12'de açıklandığı gibi, bir in situ ksenogreft osteosarkom fare modeli oluşturmak için her bir timik farenin sol tibiasına10 μL hücre süspansiyonu enjekte edin. Kısaca adımlar aşağıdaki gibidir.
- Hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın. Hücreleri 3 dakika boyunca 1.5 mL% 0.25 tripsin ile tripsinize edin. 6 mL %10 serum içeren MEM ortamı ekleyin. Hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
- Hücre sayma plakasının haznesine 20 μL hücre süspansiyonu aspire edin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu hesaplayın. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı bir pipetle atın, hücre peletini 8.5 mg/mL bazal membran matrisinde yeniden süspanse edin ve buz üzerine yerleştirin.
- Fareleri %2 izofluran ve %98 oksijene (oksijen akış hızı, 2 L/dk) maruz bırakarak uyuşturun. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere az miktarda veteriner merhemi sürün.
- Tüm prosedürü iyi havalandırılan bir alanda gerçekleştirin. Osteosarkom hücre enjeksiyonundan önce, ayağa hafifçe dokunarak her farenin derin anestezi altında olduğundan emin olun; Farenin hala seğirme veya sarsıntı gibi yanıtları varsa. Farenin hala seğirme veya sarsıntı gibi yanıtları varsa, bu yanıtlar kaybolana kadar daha uzun süre bekleyin.
- Fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak farenin ayak bileğini tutun ve tibianın enjeksiyon bölgesini üç alternatif betadin ve% 70 etanol çubuğu ile dezenfekte edin.
- İğneyi 1 mL'lik bir şırıngaya takın ve iğne ucunu tibia eksenine paralel olarak enjeksiyon bölgesine doğru tutun. Tibia platformundan tibianın distal ucuna doğru bir delik açmak için iğneyi perkütan olarak sokun.
- Daha önce buz üzerine yerleştirilen osteosarkom hücre süspansiyonunu mikro hacimli bir şırıngaya yükleyin ve tibiadaki 1 mL'lik şırıngayı osteosarkom hücresi yüklü mikro hacimli şırınga ile değiştirin. Her bir timik farenin kaval kemiğine yaklaşık 10 μL (1 x 107 hücre/mL) osteosarkom hücre süspansiyonunu yavaşça enjekte edin.
- Mikro hacimli şırıngayı enjeksiyon bölgesinden çıkarın ve enjeksiyon bölgesini pamuklu çubukla yaklaşık 30 saniye bastırın. Fareyi temiz bir kafese geri koyun ve 10 dakika boyunca iyileşmesini gözlemleyin.
5. Gavaj için geleneksel Çin tıbbı kaynatma formülünün hazırlanması (Şekil 2)
- Dozu 2. adıma göre hesaplayın.
- Pahalı bitki Ginseng hariç, tüm şifalı bitkileri kaynatma için, ilaç yüzeyinden 3 cm daha yüksek bir seviyeye sahip içme suyunda 30 dakika bekletin ve ardından kaynatma işlemini aşağıda açıklandığı gibi 2x yapın.
- İlk kaynatma işlemini güçlü bir ateşte kaynayana kadar ısıtarak ve ardından hafif bir ateşte 15-25 dakika ısıtarak gerçekleştirin. Hafif ateş, tipik olarak 80 °C ila 100 °C arasında değişen sıcaklıklara sahip düşük güçlü bir ısıyı ifade ederken, güçlü ateş, tipik olarak 200 °C ila 300 °C arasında değişen yüksek güçlü bir ısıyı ifade eder.
- Kaynatma sıvısını bir kaba dökün.
- İkinci kaynatmayı, şifalı bitkileri içme suyunda, ilaç yüzeyini batırmaya yetecek bir hacimde, güçlü bir ateşte kaynatarak ve ardından hafif bir ateşte 15-25 dakika ısıtarak gerçekleştirin.
- Kaynatma sıvısını adım 5.4'teki gibi aynı kaba dökün.
- Pahalı olduğu için 42 g Ginseng'i ayrı ayrı, ilaç yüzeyinden 3 cm daha yüksek içme suyuyla ıslatın ve kaynatın.
- Islatılmış Ginseng'in ilk kaynatma işlemini 60 dakika boyunca güçlü bir ateşte ısıtarak gerçekleştirin.
Kaynatma sıvısını adım 5.4'teki gibi aynı kaba dökün. - Ginseng'in ikinci kaynatma işlemini, 40 dakika boyunca hafif bir ateşte ısıtarak, ilaç yüzeyini batırmaya yetecek bir hacme sahip içme suyunda gerçekleştirin. Kaynatma sıvısını adım 5.4'teki gibi aynı kaba dökün.
NOT: Kaynatma için kullanılan kaplar, tıbbi maddelerle olası kimyasal reaksiyonları önlemek için güveç (klinik uygulamada en yaygın kullanılan), seramik, cam ve paslanmaz çelik gibi kimyasal olarak kararlı olmalıdır. Farklı adımlardan elde edilen tüm kaynatma sıvıları aynı kaba konulmalıdır. - Lastik bantlı bir ölçüm kabının ağzına sabitlenmiş üç kat gazlı bez kullanarak kaynatma sıvısını karıştırın ve süzün.
- Filtrelenmiş kaynatma maddesini bir tencerede güçlü bir ateşte kaynatın, ardından hafif ateşe geçin ve hedef konsantrasyona ulaşana kadar hafif ateşi tutun (son konsantrasyon 1,5 g/mL olan 84 mL'lik bir nihai hacim).
- 1 hafta boyunca intragastrik uygulama için gereken doza göre konsantre kaynatma 21 mL alikot hazırlayın ve alikotları -20 ° C'de buzdolabında saklayın.
6. Bir gavaj cihazı kullanarak farelerde gavaj uygulaması
- Fareyi fare kafesinin yüzeyine veya daha pürüzlü başka bir yüzeye yerleştirin.
- Farenin kuyruğunu sağ elin başparmağı ve işaret parmağıyla kavrayın. Ardından, sol elin başparmağı, işaret parmağı ve orta parmağıyla farenin boynunu kavrayın.
- Farenin başını, boynunu ve gövdesini düz bir çizgide yapmak için sol elin diğer iki parmağıyla fare kuyruğunu tutun.
NOT: Tüm kavrama işlemi boyunca fareyi rahat tuttuğunuzdan emin olun. Fare hareket etmekte zorlanmaya devam ederse, fare rahatlayana kadar kavrama işlemi gerçekleştirilmelidir. - Gavaj cihazını sağ elinizde tutun ve 20 g vücut ağırlığına sahip bir fare için 200 μL kaynatma formülü yükleyin (100 μL kaynatma formülü/farenin 10 g vücut ağırlığı).
- Gavaj iğnesini köşeden ağza sokun ve dili farenin üst çenesine doğru itin.
- Fare gövdesini aynı yönde tutun ve gavaj iğnesinin yaklaşık 10 mm'si dışarıda kalana kadar gavaj iğnesini yemek borusu boyunca mideye doğru hafifçe itin.
NOT: Gavaj iğnesi yemek borusuna girdiğinde çukurluk hissi vardır. Fareye sokulan gavaj iğnesinin uzunluğu sternumun tepesine kadar ölçülmelidir. Gavaj iğnesinin toplam uzunluğu 60 mm'dir (Şekil 3), bu nedenle, kaynatma formülü farenin midesine enjekte edilmeden önce yaklaşık 50 mm'lik gavaj iğnesi farenin gövdesine yerleştirilmelidir. - Kaynatma formülünü farenin midesine enjekte edin. Dirençle karşılaşmak veya ağız köşesinden sıvı gelmesi, gavaj iğnesinin yanlış yerleştirilmesi anlamına gelir ve bundan kaçınılmalıdır. Ek olarak, kaynatma formülü kalınsa enjeksiyon hızı yavaşlatılmalıdır.
- Fareyi bırakın ve 10 dakika boyunca gözlemleyin. Solunum anormalliği gözlenmezse gavaj başarılı olur ve fareyi kafese geri döndürür (Şekil 4).
7. Tedavi süresi
- Yiqi Jiedu kaynatma işleminin terapötik etkinliğini keşfetmek için bir kontrol grubu ve bir Yiqi Jiedu kaynatma grubu kurun. Kontrol grubundaki fareler için, 28 gün boyunca günde bir kez fizyolojik salin uygulayın. Yiqi Jiedu kaynatma grubundaki fareler için, Yiqi Jiedu kaynatma işlemini 28 gün boyunca günde bir kez uygulayın.
8. Olumsuz reaksiyonlar
- Farelerin kafese geri yerleştirildikten sonra, kilo kaybı ve yiyeceklerin mideye girememesi nedeniyle zihinsel durumun azalması da dahil olmak üzere durumunu yakından gözlemleyin.
- Fareler, gıdaya bağlı trakeal tıkanıklık nedeniyle nefes almada zorluk ve nefes darlığı yaşayacak ve trakeayı temizlemek için öksüreceklerdir. Gavaj sırasında bu semptomlardan herhangi biri gözlenirse, gavajı hemen durdurun ve farelere ötenazi yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yiqi Jiedu kaynağının in vivo osteosarkomun büyümesi üzerindeki inhibitör etkisi, 143B osteosarkom hücrelerinin timik farelerin tibiasına enjekte edilmesiyle hazırlanan bir intra-tibial ksenogreft osteosarkom fare modelinde belirlendi. Yiqi Jiedu kaynatma, Yiqi Jiedu kaynatma grubunun farelerine 143B enjeksiyonunun ikinci gününden başlayarak 28 gün boyunca gavaj yoluyla uygulandı. Kontrol grubundaki farelere serum fizyolojik verildi. Tüm farelere 28 gün sonra ötenazi yapıldı. Sonuçlar, Yiqi Jiedu kaynatma grubundaki tümör hacminin kontrol grubununkine kıyasla önemli ölçüde azaldığını gösterdi (Şekil 5).
Şekil 1: Kaynatma sarf malzemeleri. Kaynatmaya hazır ilaç şunlardan oluşur: (A) Ginseng, (B) Hedyotis diffusa, (C) Dikenli takke otu, (D) Dereceli ölçüm kabı, (E) Lastik bantlar, (F) Gazlı bez, (G) Ölçüm kabının ağzına lastik bantlarla üç kat gazlı bez sabitlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Geleneksel Çin tıbbı için kaynatma formülünün hazırlanması. (A) Ginseng'in 30 dakika boyunca ıslatılması dışında kaynatmaya hazır ilaçlar. (B) Ginseng'in 30 dakika boyunca ayrı ayrı ıslatılması (C) Ginseng ayrı ayrı kaynatılır. (D) Geleneksel Çin tıbbının filtreleme kaynatma formülü. (E) Geleneksel Çin tıbbının konsantre kaynatma formülünün saklanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Gavaj sarf malzemeleri. Orijinal iğneli normal 1 mL şırınga (sol panel) ve orijinal iğneli 1 mL şırınga, bir gavaj cihazı ayarlamak için 12/55 mm dirsek gastrik perfüzyon iğnesi ile değiştirilir (sağ panel). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farede gavaj uygulama prosedürü. (A) Kafes yüzeyindeki fare. (B) Fare kuyruğunun tek elle kavranması. (C-D) Fare tek elle sabitleniyor. (E) Fare ağzından iğne sokulur. (F) Gavaj uygulamasının sona ermesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Osteosarkom fare modelinde kaynatma işleminin inhibitör etkisi. (A) Kontrol grubundan ve Yiqi Jiedu kaynatma müdahale grubundan toplanan osteosarkom örnekleri. Hata çubukları standart sapma (n=7) (B) Kontrol (Ctrl) grubu ile Yiqi Jiedu kaynatma müdahale grubu arasındaki tümör hacminin eşleşmemiş t testi anlamına gelir. 28 gün boyunca Yiqi Jiedu kaynatma müdahalesi tümör hacmini önemli ölçüde inhibe eder (p<0.05). Hata çubukları standart sapmayı (n=7) temsil eder. (C) Deney süresi boyunca Yiqi Jiedu kaynatma gavaj grubundaki ve kontrol grubundaki farelerin vücut ağırlığı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geleneksel Çin tıbbında reçete edilen bitkilerin klinik etkinliği büyük ölçüde uygulanan doz ve dozaj formu ile ilişkilidir; Bu nedenle, standartlaştırılmış bir kaynatma stratejisinin oluşturulması ve yetenekli bir uygulama süreci, klinik uygulamada ve deneysel sonuçların güvenilirliğinin arttırılmasında gereklidir.
Bu çalışmada, ilk olarak, geleneksel Çin tıbbının klinik uygulamasında kullanılan Çin bitkilerinin standartlaştırılmış kaynatma için ayrıntılı bir strateji sağladık, bu da insanların ilaçları bilimsel olarak kaynatmaya yönlendirilmesini kolaylaştırdı, aynı zamanda kaynatma formülünün kalitesini ve bitkisel ilaçların klinik etkinliğini pratik olarak iyileştirdi; Bu nedenle, standardizasyon sağlandıktan sonra, bitkisel ilaç etkinliğinin klinik uygulamada doğruluğunu ve tutarlılığını artıracaktır.
Gavaj stratejisi, klinik öncesi çalışmalarda oral alım yöntemi olarak yaygın bir şekilde uygulanmıştır ve fareler, sıçanlar ve tavşanlar dahil olmak üzere çeşitli deney hayvanlarına uygulanabilir, bu da uygulama kolaylığı, doğru dozaj kontrolü ve ilaç uygulamasının klinik yolunu taklit etme yeteneği gibi bazı avantajlar sunar13. Bununla birlikte, hayvanlar anestezi olmadan yanlış bir pozisyonda hareketsiz hale getirilirlerse mücadele edeceklerdir, bu da araştırmacıların sağlığını tehdit edebilir ve deneylerin güvenilirliğini azaltabilir. Bu nedenle, bu olasılıkları azaltmak ve kaynatmanın yanlışlıkla yemek borusuna girmesini veya yemek borusu hasarına neden olmasını önlemek için standart bir gavaj yönteminin kurulması önemlidir, bu da hayvan ölümüne ve deneysel başarısızlığa neden olur.
Burada, kaynatma formülünü osteosarkom model farelere iletmek için gavaj yolunu seçtik, çünkü bu, dozu tam olarak ölçmemize ve deney boyunca tutarlı ilaç dağıtımını garanti etmemize izin verdi. Kaynatma formülünü hazırlamak için, önce vücut ağırlığı 60 kg olan yetişkinler için kullanılan miktarın 20 katı bir orana dayanarak fare için kaynatmaya hazır ilaçların miktarını hesapladık; ıslatılır ve kaynama noktasına kadar ısıtılarak 2 kez kaynatılır; filtre konsantre edildi ve kaynatma -20 ° C'de alikotlarda saklandı. Gavaj uygulamasını gerçekleştirmek için, 200 μL konsantre kaynatma formülünü bir gavaj cihazına yükleyin, gavaj iğnesini ağza sokun, gavaj iğnesini yavaşça mideye doğru itin ve kaynatma formülünü farenin midesine enjekte edin. Bulgularımızdan biri, gavaj yoluyla Yiqi Jiedu kaynatma formülünü alan grupta gözlenen tümör büyümesinin önemli ölçüde inhibisyonudur. Yiqi Jiedu kaynatma grubunda kontrol grubuna kıyasla tümör hacminde belirgin bir azalma gözlemledik. Bu sonuçlar, gavaj stratejisinin, kaynatma formülünün aktif bileşenlerini hedef bölgeye etkili bir şekilde ilettiğini ve bunun da güçlü anti-tümör etkileriyle sonuçlandığını göstermektedir. Ayrıca, deney süresi boyunca farelerin genel durumunu ve vücut ağırlığını izleyerek gavaj stratejisinin güvenlik profilini değerlendirdik. Yiqi Jiedu kaynatma gavaj grubu ile kontrol grubu arasında vücut ağırlığı değişiklikleri veya toksisite belirtileri açısından önemli bir fark bulamadık, bu da kaynatma formülünün gavaj uygulamasının iyi tolere edildiğini ve belirgin yan etkilere neden olmadığını gösteriyor.
Gavaj stratejisinin kaynatma formülünün deney hayvanlarına verilmesinde etkili olduğu kanıtlanmış olsa da, bu uygulama yöntemiyle ilişkili potansiyel advers reaksiyonların ve belirli sınırlamaların farkına varmak önemlidir. Gıdaya bağlı trakea tıkanıklığını önlemek için, nefes almada zorluk, nefes darlığı ve öksürük gibi gavaj sırasında ve sonrasında fare durumunu yakından gözlemleyin. Bunlardan herhangi biri göründüğünde, gavajı hemen durdurun ve yatay bir sert masaüstünde göğüs kompresyonları yapın; Ayrıca, herhangi bir ciddi durum için acil veteriner yardımı gereklidir. Ayrıca, aşağıdaki sınırlamalara çok dikkat etmemiz gerekiyor. İlk olarak, gavaj hayvanlarda strese neden olabilir, potansiyel olarak genel fizyolojilerini ve tedaviye yanıtlarını etkileyebilir. Bununla birlikte, küçük bir besleme iğnesi kullanarak ve gavaj prosedürü sırasında fareleri nazikçe tutarak stresi en aza indirmek için önlemler aldık. Ayrıca, gavaj yalnızca hayvanlara olası zararı önlemek için standart bir tekniğin kullanılmasını sağlamak için özel olarak eğitilmiş ve kalifiye bir kişi tarafından gerçekleştirilebilirdi14. İkincisi, kaynatma formülünün aktif bileşenlerinin anti-tümör etkilerini uyguladığı kesin mekanizma belirsizliğini korumaktadır. Gavaj stratejisinin bitkisel bileşiklerin farmakokinetiğini ve farmakodinamiğini değiştirmesi, potansiyel olarak biyoyararlanımlarını ve terapötik etkinliklerini etkilemesi mümkündür. Gelecekteki çalışmalar, gavaj yoluyla verilen kaynatma formülünün anti-tümör etkilerinin altında yatan kesin mekanizmaları aydınlatmaya odaklanmalıdır. Ayrıca, uzun süreli gavaj sırasında izofluran anestezi uygulamasının, eksik kaynatma alımını ve vasıfsız gavaj tekniğine bağlı hayvan ölümlerini azalttığı bildirilmiştir15. Bu arada, kaynatma işlemine yemeklik yağ eklemek, gavajla ilişkili hayvan stresini azaltır16.
Sonuç olarak, Çin bitkilerinin standartlaştırılmış kaynatma sürecini ve fareler için yetenekli gavaj stratejisini sağladık. Bu çabalar sadece deney farelerinin olası özofagus yaralanmalarını ve ölümünü önlemekle kalmaz, aynı zamanda her deney hayvanının eşit miktarda bitkisel ilaç vermesini sağlayan ilaç taşmalarını da önler, bu nedenle deneysel sonuçların doğruluğunu ve tutarlılığını ve ayrıca terapötik etkileri artırır. Çalışmamız, bir osteosarkom fare modelinde geleneksel Çin tıbbı kaynatma formülünün uygulanması için gavaj stratejisinin etkinliğini ve güvenliğini göstermektedir. Bu sonuçlar, osteosarkom tedavisinde bu uygulama yönteminin potansiyelini vurgulamakta ve geleneksel Çin tıbbı uygulamasının gavaj stratejisini optimize etmede daha fazla araştırma için temel oluşturmaktadır. Ek olarak, gelecekteki çalışmalar, kaynatma formülündeki aktif bileşenlerin kesin etki mekanizmalarını araştırmalı ve osteosarkom hastalarında terapötik sonuçları iyileştirmek için diğer tedavi yöntemleriyle potansiyel sinerjik etkileri araştırmalıdır. Bu nedenle, bu bulgular bu uygulama yönteminin potansiyel yararlarına ve sınırlamalarına ışık tutmakta ve osteosarkom tedavisindeki uygulamasına ilişkin değerli bilgiler sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar açıklayacak hiçbir şeyleri olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Mevcut çalışma, (1) Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973877 ve 82174408), (2) Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2020YFE0201600), (3) Şanghay En Öncelikli Araştırma Merkezi inşaat projesi (2022ZZ01009), (4) Hastane TCM Hazırlığının Endüstriyel Dönüşümü için Şanghay İşbirlikçi İnovasyon Merkezi ve (5) Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Bütçesi kapsamındaki Araştırma Projeleri (2021LK047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | Male | Animal |
| Barbed skullcap herb | Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd. | 20230606 | Decoction-ready medicines |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm) | RWD Life Science Co., Ltd. | C21014-12 | Component of gastric perfusion device |
| Gauze | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | LC45 | Decoction filter |
| Ginseng | Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd. | 20220704-2 | Decoction-ready medicines |
| Hedyotis diffusa | Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd. | 2023071107 | Decoction-ready medicines |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| Rubber bands | Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd. | XPJ | Fixing gauze on the measuring cup |
| Syringe (1 mL ) | Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd. | SBM0040 | Component of gastric perfusion device |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
References
- Gao, S. Discussion on advantages and improvement of traditional Chinese medicine decoction. Chinese Community Physicians (Comprehensive Edition). (21), 12 (2005).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. , (2015).
- An, Y., et al. Interpretation on specification of traditional Chinese medicine decoction. Herald Med. 42 (11), 1648-1652 (2023).
- Chen, S., et al. Research strategies in standard decoction of medicinal slices. China J Chinese Materia Medica. 41 (8), 1367-1375 (2016).
- Luo, F. Effect of soaking traditional Chinese medicine before decoction on active components. Shanghai Yiyao. 40 (9), 63-64 (2019).
- Liu, F., Chen, M. On the standardization of decocting methods of modern decoction. Global Trad Chinese Med. 7 (5), 377-378 (2014).
- Li, X., et al. Influence of decocting times and instrument on the quality of decoction. J Trad Chinese Med. 50 (6), 550-552 (2009).
- Li, X., et al. Herbal decoctosome is a novel form of medicine. Sci China. Life Sci. 62 (3), 333-348 (2019).
- Lan, Y., Hu, Y., Huang, W., Tang, S. Reflections on PK - PD model based on animal experiments for study of Chinese medicine. Lishizen Med Materia Medica Res. 34 (2), 395-397 (2023).
- Li, Y., Bai, M., Song, Y., Guo, H., Miao, M. Research and reflection on standard decoction of Chinese materia medica. Chinese Trad Herbal Drugs. 49 (17), 3977-3980 (2018).
- Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers. , https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/estimating-maximum-safe-starting-dose-initial-clinical-trials-therapeutics-adult-healthy-volunteers (2005).
- Chang, J., et al. Intratibial osteosarcoma cell injection to generate orthotopic osteosarcoma and lung metastasis mouse models. J Vis Exp. (176), 63072 (2021).
- He, C.
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Fronti Pedia. 2, 93 (2014).
- Jones, C. P., Boyd, K. L., Wallace, J. M. Evaluation of mice undergoing serial oral gavage while awake or anesthetized. J Am Assoc Lab Animal Sci. 55 (6), 805-810 (2016).
- Recena Aydos, L., et al. Nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet in C57bl/6 models. Nutrients. 11 (12), 3067 (2019).
