Summary
Het protocol biedt een gedetailleerd standaardisatieproces van afkookselformule en sondetechniek met Yiqi Jiedu-afkooksel in het osteosarcoommuismodel als voorbeeld. Het beschrijft de bescherming van dieren en verbetert de betrouwbaarheid van onderzoeksgegevens, en biedt effectieve strategieën voor het onderzoeken van therapeutische werkzaamheid en moleculaire mechanismen van afkookselformules in vivo.
Abstract
Afkookselformule is de meest gebruikte doseringsvorm in de traditionele Chinese geneeskunde en wordt al duizenden jaren in de klinische praktijk toegepast door transorale toediening, die wordt gekenmerkt door een snel effect, gemakkelijke absorptie en geïndividualiseerde behandeling op basis van de specifieke syndromen van patiënten. De kwaliteit van de afkookformule is direct verantwoordelijk voor de klinische werkzaamheid van de traditionele Chinese geneeskunde; Daarom is het standaardisatieproces van de afkookformule belangrijk om verschillen in afkookselkwaliteit veroorzaakt door subjectieve factoren te voorkomen. Ondertussen, vanwege de beperkingen van het uitvoeren van klinische experimenten, worden kleine dieren met menselijke ziekten, zoals muizen, vaak gebruikt in medisch onderzoek om de therapeutische werkzaamheid en uitgebreide mechanismen van verschillende interventies te onderzoeken, waaronder de afkookformule voor traditionele Chinese geneeskunde. Bijgevolg is de bekwame maagsondetechniek, als een belangrijke transorale toedieningsmethode, bijzonder belangrijk om mogelijke schade aan de slokdarm en het morsen van geneesmiddelen te voorkomen, wat ervoor zorgt dat aan elk modeldier een gelijke hoeveelheid geneesmiddel wordt toegediend, wat leidt tot nauwkeurige experimentele resultaten. Bovendien zijn de gestandaardiseerde methode voor de bereiding van afkookselformules en de bekwame maagsondestrategie noodzakelijk om het dierenwelzijn te beschermen en het aantal gebruikte dieren te minimaliseren. Hier rapporteerden we een gedetailleerd standaardisatieproces van de afkookformule en gavage-techniek met Yiqi Jiedu-afkooksel in osteosarcoommuismodel als voorbeeld. De werkzaamheid werd geëvalueerd aan de hand van het tumorvolume. Dit protocol zal de bescherming van dieren maximaliseren en de betrouwbaarheid van onderzoeksgegevens verbeteren, waardoor effectieve strategieën worden geboden voor toekomstig onderzoek naar therapeutische werkzaamheid en moleculaire mechanismen van afkookselformule voor traditionele Chinese geneeskunde in vivo.
Introduction
Afkookselformule is de meest gebruikte doseringsvorm van de traditionele Chinese geneeskunde en de vloeibare geneesmiddelen 1,2. De afkookselformule van de traditionele Chinese geneeskunde wordt verwerkt door de kruiden na weken in water af te koken, gevolgd door filtering om het bezinksel weg te gooien.
Omdat de afkookformule kan worden geïndividualiseerd op basis van klinische behoeften, vooral in overeenstemming met de kenmerken van evidence-based behandeling in de traditionele Chinese geneeskunde, wordt deze toedieningsvorm via transorale toediening al duizenden jaren in de klinische praktijk toegepast met specifieke en onvervangbare voordelen 3,4. De kwaliteit van de afkookformule is direct gerelateerd aan de klinische werkzaamheid. Daarom moet de afkookformule worden bereid op basis van de principes voor de gestandaardiseerde afkookmethoden om ervoor te zorgen dat de actieve ingrediënten maximaal worden geëxtraheerd en beschermd3. Ondertussen zijn afkookselklare medicijnen de belangrijkste vorm van rauwe Chinese kruiden die in de klinische praktijk worden gebruikt; de kwaliteitsnormen en productiemethoden van geneesmiddelen die klaar zijn voor afkooksel moeten voldoen aan de bepalingen van de Chinese Farmacopee2. Bovendien moeten de voorgeschreven afkookselklare medicijnen ten minste 30 minuten in koud drinkwater worden geweekt voordat ze in een speciale farmaceutische pot worden afkooksel door verhitting5. Studies hebben aangetoond dat de meeste actieve ingrediënten kunnen worden geëxtraheerd door twee keer een afkooksel te gebruiken, en de praktijkcode voor de toediening van afkookkamers van traditionele Chinese medicijnen in medische instellingen schrijft ook voor dat afkooksel twee keer moet worden gedaan 4,6,7. Als speciale Chinese kruiden, zoals een met een harde textuur of tonics, worden voorgeschreven, wordt aanbevolen om de afkooktijd te verlengen. Het afkookgerei en de opslagcontainers die direct in contact komen met de afkookformule, te beginnen met de container waarin de voorgeschreven afkookselklare medicijnen zijn gedrenkt, moeten chemisch stabiel zijn en deksels hebben, zoals stoofschotels, keramiek, glas en roestvrij staal. Aluminium en gewone plastic producten mogen echter niet worden gebruikt, terwijl ijzer en ander bijtend keukengerei moeten worden verboden om mogelijke chemische reacties te voorkomen, die de therapeutische werkzaamheid verminderen en zelfs schadelijke effecten veroorzaken 4,6,7.
Vanwege de beperkingen van het uitvoeren van klinische experimenten, worden kleine dieren die de menselijke ziekten dragen, zoals muizen, vaak gebruikt in medisch onderzoek om de therapeutische werkzaamheid en uitgebreide mechanismen van verschillende interventies te onderzoeken, waaronder de afkookformule van de traditionele Chinese geneeskunde 8,9; In tegenstelling tot mensen moeten de afkookselformules echter elke dag worden bereid, met elkaar worden gemengd en in de klinische praktijk 2x per dag vers worden toegediend. Dieren zijn niet in staat om vrijwillig hun medicijnen op tijd in te nemen met de vereiste dosering, en de meeste dierproeven met betrekking tot de traditionele Chinese geneeskunde zijn momenteel op maagsonde gebaseerde orale toediening van de afkookselformules. De afkooksels die voor in-vivodierproeven worden gebruikt, moeten van tevoren worden bereid, gealiquoteerd, bij -20 °C worden bewaard en vlak voor gebruik worden ontdooid 3,4,10. Bovendien verhogen ondermaatse immobilisatie van dieren en manipulatie van sondenaalden het risico op onnodige verwondingen en negatieve emoties. Daarom is de bekwame maagsondetechniek, als een belangrijke methode voor transorale toediening van geneesmiddelen, bijzonder belangrijk om mogelijk slokdarmletsel en morsen van geneesmiddelen te voorkomen, en er zo voor te zorgen dat elk modeldier een gelijke hoeveelheid voorgeschreven kruidengeneesmiddelen krijgt om nauwkeurige experimentele resultaten te bereiken. Hier bieden we een maagsondeprotocol voor de afkookformule van de traditionele Chinese geneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol beschrijft de gedetailleerde sondetechniek in osteosarcoommodelmuizen door het afkooksel van Yiqi Jiedu als monster te gebruiken. Vier weken oude, mannelijke athymische muizen (BALB/c naakt) werden in dit experiment gebruikt en gehouden in de SPF-kwaliteit kweekruimte van het Laboratory Animal Center in Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het Animal Management and Committee van de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, voldeden aan de Code of Ethics for Laboratory Animals (Animal Ethics Approval Number: PZSHUTCM2304060007) en werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de internationale vereisten met betrekking tot proefdieren.
1. Materialen
- Verkrijg de volgende materialen: Chinese kruiden (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, glidkruid met weerhaken 31,5 g), spuit van 1 ml en 12 G/55 mm elleboognaald (Figuur 1).
2. Bepaling van de dosering
- Bereken de dagelijkse dosering als volgt: de dagelijkse dosering voor volwassenen met een standaard lichaamsgewicht van 60 kg is Ginseng 12 g, Hedyotis diffusa 15 g en Weerhaak glidkruid 9 g, met een totaal van 36 g afkooksel-klaar medicijn, dat wil zeggen 0,6 g afkooksel-klaar medicijn/kg lichaamsgewicht. Verwijzend naar de 12 keer voor equivalente dosis, 6 keer voor lage dosis en 24 keer voor hoge dosis tussen de volwassenen met een standaard lichaamsgewicht van 60 kg en de muizen met een standaard lichaamsgewicht van 25 g volgens het lichaamsoppervlak11, evenals onze voorlopige gegevens, gebruik een 20 keer dosisverhouding van Yiqi Jiedu-afkooksel voor de muizen in de huidige studie, Daarom was de dosering voor muizen 12 g afkookselklare medicijnen/kg lichaamsgewicht.
- Bereken de dosering voor elke muis met behulp van de vergelijking:
Dosering voor muis (lichaamsgewicht van de standaard) = Dosering voor volwassene (lichaamsgewicht van de standaard) x 20 (aangeduide equivalente dosisverhouding).
De dagelijkse dosering van elke muis is 0,3 g [(12 g afkookselklare geneesmiddelen/1000 g lichaamsgewicht) x 25 g lichaamsgewicht] in 200 μL met een eindconcentratie van 1,5 g/ml. - Bereken het totale afkooksel voor muizen (n=7) in de Yiqi Jiedu-afkookselgroep met maagsonde gedurende 28 dagen op 58,8 g. Concentreer dit tot 39,2 ml om een eindconcentratie van 1,5 g/ml te bereiken.
- Rekening houdend met mogelijk medicijnverlies tijdens het afkooksel en de maagsonde, en voor het gemak van de berekening, bereidt u in totaal 126 g (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, Weerhaak glidkruid 31,5 g) afkookselklaar medicijn, concentreer in een uiteindelijk volume van 84 ml.
3. Celbron en -kweek
- Koop van mensen afgeleide 143B-osteosarcoomcellen van de ATCC-celbank.
- Zaad 1 x 106 143B-cellen in 10 ml MEM-medium met 10% FBS, 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine in een celkweekschaaltje van 10 cm.
- Kweek 143B-cellen bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator totdat de cellen voor 80%-90% samenvloeien.
4. Modelleringsmethoden
- Verzamel de 80% confluente gekweekte 143B-cellen, resuspendeer in 6 ml 10% serumbevattend MEM-medium en meng met basale membraanmatrixgel in een volumeverhouding van 1:1 om een celsuspensie te maken met een eindconcentratie van 1 x 107 cellen/ml.
- Injecteer 10 μL van de celsuspensie in het linker scheenbeen van elke athymische muis om een in situ xenotransplantaat osteosarcoom muismodel op te zetten, zoals beschreven in onze vorige publicatie12. De stappen in het kort zijn als volgt.
- Was de cellen 2x met PBS. Trypsiniseer de cellen met 1,5 ml 0,25% trypsine gedurende 3 minuten. Voeg 6 ml 10% serumbevattende MEM-media toe. Verzamel de cellen in een centrifugebuisje van 15 ml.
- Zuig 20 μL celsuspensie op in de kamer van de celtelplaat en bereken de celconcentratie met behulp van een automatische celteller. Centrifugeer de cellen op 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatans weg met een pipet, resuspendeer de celpellet in een basaalmembraanmatrix van 8,5 mg/ml en leg ze op ijs.
- Verdoof de muizen door ze bloot te stellen aan 2% isofluraan en 98% zuurstof (zuurstofdebiet, 2 l/min). Breng een kleine hoeveelheid dierenartszalf aan op de ogen om uitdroging onder narcose te voorkomen.
- Voer de hele procedure uit in een goed geventileerde ruimte. Zorg er vóór de injectie van osteosarcoomcellen voor dat elke muis onder diepe anesthesie is door de voet zachtjes aan te raken; als de muis nog steeds reacties heeft, zoals trillen of schokken. Wacht langer als de muis nog steeds reacties heeft, zoals trillen of schokken, totdat deze reacties verdwijnen.
- Plaats de muis in rugligging. Houd de enkel van de muis vast met duim en wijsvinger en desinfecteer de injectieplaats van het scheenbeen met drie afwisselende rondes betadine en 70% ethanolwattenstaafje.
- Bevestig de naald aan een spuit van 1 ml en richt de punt van de naald op de injectieplaats, evenwijdig aan de as van het scheenbeen. Steek de naald percutaan in om een gat te boren door het scheenbeenplatform in de richting van het distale uiteinde van het scheenbeen.
- Laad de osteosarcoomcelsuspensie die eerder op ijs is geplaatst in een injectiespuit met microvolume en vervang de spuit van 1 ml in het scheenbeen door de met osteosarcoomcellen beladen microvolumespuit. Injecteer langzaam ongeveer 10 μL (1 x 107 cellen/ml) osteosarcoomcelsuspensie in het scheenbeen van elke athymische muis.
- Verwijder de injectiespuit met microvolume van de injectieplaats en druk met het wattenstaafje ongeveer 30 s op de injectieplaats. Plaats de muis terug in een schone kooi en observeer het herstel gedurende 10 minuten.
5. Bereiding van afkookselformule uit de traditionele Chinese geneeskunde voor maagsonde ( Figuur 2)
- Bereken de dosering volgens stap 2.
- Week alle geneeskrachtige kruiden voor afkooksel, behalve het dure kruid Ginseng, gedurende 30 minuten in drinkwater met een niveau dat 3 cm hoger is dan het medicijnoppervlak, en voer vervolgens het afkooksel 2x uit zoals hieronder beschreven.
- Voer het eerste afkooksel uit door te verwarmen tot het kookt boven een sterk vuur en vervolgens gedurende 15-25 minuten te verwarmen op een mild vuur. Milde brand verwijst naar een warmte met een laag vermogen met temperaturen die doorgaans variëren van 80 °C tot 100 °C, terwijl sterk vuur verwijst naar een krachtige warmte die doorgaans varieert van 200 °C tot 300 °C.
- Giet de afkookselvloeistof in een bakje.
- Voer het tweede afkooksel uit door de geneeskrachtige kruiden in drinkwater te verwarmen, met een volume dat net genoeg is om het medicijnoppervlak onder te dompelen, tot koken boven een sterk vuur en vervolgens gedurende 15-25 minuten verwarmen boven een mild vuur.
- Giet de afkookvloeistof in hetzelfde bakje als in stap 5.4.
- Week en kook 42 g Ginseng apart, met drinkwater dat 3 cm hoger is dan het medicijnoppervlak, omdat het duur is.
- Voer het eerste afkooksel van geweekte ginseng uit door het gedurende 60 minuten boven een sterk vuur te verwarmen.
Giet de afkookvloeistof in hetzelfde bakje als in stap 5.4. - Voer het tweede afkooksel van Ginseng uit in drinkwater met een volume dat net genoeg is om het medicijnoppervlak onder te dompelen, door gedurende 40 minuten op een mild vuur te verwarmen. Giet de afkookvloeistof in hetzelfde bakje als in stap 5.4.
OPMERKING: De containers die voor afkooksel worden gebruikt, moeten chemisch stabiel zijn, zoals stoofschotels (de meest gebruikte in de klinische praktijk), keramiek, glas en roestvrij staal om mogelijke chemische reacties met de medicinale stoffen te voorkomen. Alle afkookselvloeistof die uit verschillende stappen is verkregen, moet in dezelfde container worden gedaan. - Meng en filter de afkookvloeistof met behulp van drie lagen gaas die met elastiekjes aan de mond van een maatbeker zijn bevestigd.
- Kook het gefilterde afkooksel op een sterk vuur in een pan, verander dan naar mild vuur en houd het milde vuur aan tot het bereiken van de doelconcentratie (een eindvolume van 84 ml met een eindconcentratie van 1,5 g/ml).
- Bereid 21 ml aliquots van het geconcentreerde afkooksel volgens de dosis die nodig is voor intragastrische toediening gedurende 1 week en bewaar de aliquots in de koelkast bij -20 °C.
6. Maagsonde toediening bij muizen met behulp van een maagsonde
- Plaats de muis op het oppervlak van de muizenkooi of een ander ruwer oppervlak.
- Pak de staart van de muis vast met de duim en wijsvinger van de rechterhand. Pak vervolgens de nek van de muis vast met de duim, wijsvinger en middelvinger van de linkerhand.
- Houd de muisstaart vast met de andere twee vingers van de linkerhand om het hoofd, de nek en het lichaam van de muis in een rechte lijn te maken.
NOTITIE: Zorg ervoor dat u de muis ontspannen houdt tijdens het hele grijpproces. Als de muis moeite blijft hebben om te bewegen, moet het grijpproces worden uitgevoerd totdat de muis ontspannen is. - Houd het sondeapparaat in de rechterhand en laad 200 μL afkookselformule voor een muis met 20 g lichaamsgewicht (100 μL afkookselformule/10 g lichaamsgewicht van muis).
- Steek de sondenaald vanuit de hoek in de mond en duw de tong tegen de bovenkaak van de muis.
- Houd het muislichaam in dezelfde richting en duw de maagsondenaald voorzichtig in de richting van de maag langs de slokdarm totdat ongeveer 10 mm van de maagsondenaald buiten blijft.
OPMERKING: Er is een hol gevoel wanneer de sondenaald in de slokdarm komt. De lengte van de sondenaald die in de muis wordt ingebracht, moet worden gemeten tot aan de bovenkant van het borstbeen. De totale lengte van de maagsondenaald is 60 mm (figuur 3), daarom moet ongeveer 50 mm van de maagsondenaald in het lichaam van de muis worden ingebracht voordat de afkookselformule in de maag van de muis wordt geïnjecteerd. - Injecteer de afkookformule in de maag van de muis. Weerstand of vloeistof die uit de mondhoek komt, betekent dat de sondenaald verkeerd wordt geplaatst, wat moet worden vermeden. Bovendien moet de injectiesnelheid worden vertraagd als de afkookformule dik is.
- Laat de muis los en observeer ze gedurende 10 minuten. De maagsonde is succesvol als er geen ademhalingsafwijking wordt waargenomen en de muis terug in de kooi wordt geplaatst (Figuur 4).
7. Verloop van de behandeling
- Om de therapeutische werkzaamheid van Yiqi Jiedu-afkooksel te onderzoeken, zet je een controlegroep en een Yiqi Jiedu-afkookselgroep op. Voor muizen in de controlegroep, fysiologische zoutoplossing toedienen, eenmaal per dag gedurende 28 dagen. Voor muizen in de Yiqi Jiedu-afkookselgroep, dien het Yiqi Jiedu-afkooksel eenmaal per dag gedurende 28 dagen toe.
8. Bijwerkingen
- Observeer nauwlettend de status van de muizen nadat ze terug in de kooi zijn geplaatst, inclusief gewichtsverlies en verminderde mentale toestand als gevolg van het onvermogen van voedsel om in de maag te komen.
- Muizen zullen ademhalingsmoeilijkheden en kortademigheid ervaren als gevolg van door voedsel veroorzaakte tracheale obstructie en zullen hoesten in een poging de luchtpijp vrij te maken. Als een van deze symptomen wordt waargenomen tijdens de maagsonde, stop dan onmiddellijk met de maagsonde en euthanaseer de muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het remmende effect van Yiqi Jiedu-afkooksel op de groei van osteosarcoom in vivo werd bepaald in een intra-tibiaal xenotransplantaat osteosarcoommuismodel, dat werd bereid door de 143B osteosarcoomcellen in het scheenbeen van athymische muizen te injecteren. Het Yiqi Jiedu-afkooksel werd gedurende 28 dagen vanaf de tweede dag van de 143B-injectie toegediend aan de muizen van de Yiqi Jiedu-afkookgroep via een maagsonde. Fysiologische zoutoplossing werd gegeven aan de muizen in de controlegroep. Alle muizen werden na 28 dagen geëuthanaseerd. De resultaten toonden aan dat het tumorvolume in de Yiqi Jiedu-afkookgroep significant was verminderd in vergelijking met dat van de controlegroep (Figuur 5).
Figuur 1: Afkookselverbruiksartikelen. Het afkookgeneesmiddel bestaat uit (A) Ginseng, (B) Hedyotis diffusa, (C) Glidkruid met weerhaken, (D) Gegradueerde maatbeker, (E) Elastiekjes, (F) Gaas, (G) Bevestiging van drie lagen gaas aan de mond van de maatbeker met elastiekjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bereiding van afkookselformule voor de traditionele Chinese geneeskunde. (A) De afkookselklare geneesmiddelen, met uitzondering van Ginseng die 30 minuten wordt geweekt. (B) Ginseng die afzonderlijk wordt geweekt gedurende 30 minuten. (C) Ginseng wordt apart geweekt. (D) Filterende afkookselformule van traditionele Chinese geneeskunde. (E) Opslag van geconcentreerde afkookselformule van traditionele Chinese geneeskunde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Verbruiksartikelen voor maagsonde. Gewone spuit van 1 ml met originele naald (linkerpaneel) en spuit van 1 ml met originele naald die wordt vervangen door een elleboogmaagperfusienaald nr. 12/55 mm om een sonde-apparaat in te stellen (rechterpaneel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Procedure voor het toedienen van een maagsonde bij muizen. (A) Muis op het oppervlak van de kooi. (B) De staart van de muis wordt met één hand vastgegrepen. (C-D) Muis wordt met één hand vastgezet. (E) Naald wordt ingebracht vanuit de mond van de muis. (F) Beëindiging van de maagsondetoediening. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Remmend effect van het afkooksel in het osteosarcoommuismodel. (A) Osteosarcoommonsters die worden verzameld van de controlegroep en de Yiqi Jiedu-afkookselinterventiegroep. Foutbalken staan voor standaarddeviatie (n=7) (B) Ongepaarde t-test van tumorvolume tussen controlegroep (Ctrl) en Yiqi Jiedu-afkookselinterventiegroep. Yiqi Jiedu-afkookselinterventie gedurende 28 dagen remt het tumorvolume aanzienlijk (p<0,05). Foutbalken staan voor standaarddeviatie (n=7). (C) Lichaamsgewicht van muizen in de Yiqi Jiedu-afkookselgroep en de controlegroep gedurende de experimentele periode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De klinische werkzaamheid van de voorgeschreven kruiden in de traditionele Chinese geneeskunde hangt grotendeels samen met de toegediende dosis en doseringsvorm; Daarom zijn de vaststelling van een gestandaardiseerde afkookstrategie en een bekwaam toedieningsproces noodzakelijk in de klinische praktijk, evenals bij het verbeteren van de betrouwbaarheid van experimentele resultaten.
In deze studie hebben we eerst een gedetailleerde strategie gegeven voor het gestandaardiseerde afkooksel van Chinese kruiden dat wordt gebruikt in de klinische praktijk van de traditionele Chinese geneeskunde, wat de begeleiding van mensen naar wetenschappelijk afkooksel van medicijnen vergemakkelijkt, ook praktisch de kwaliteit van de afkookformule en de klinische werkzaamheid van kruidengeneesmiddelen verbetert; Daarom, zodra de standaardisatie is bereikt, zal dit de nauwkeurigheid en consistentie van de werkzaamheid van kruidengeneesmiddelen in de klinische praktijk verbeteren.
De maagsondestrategie is op grote schaal toegepast als orale innamemethode in preklinische onderzoeken en is toepasbaar op verschillende proefdieren, waaronder muizen, ratten en konijnen, wat enkele voordelen biedt, zoals gemak van toediening, nauwkeurige doseringscontrole en het vermogen om de klinische toedieningsroute van het geneesmiddel na tebootsen13. De dieren zullen het echter moeilijk hebben als ze zonder verdoving in een verkeerde positie worden geïmmobiliseerd, wat de gezondheid van de onderzoekers kan bedreigen en de betrouwbaarheid van de experimenten kan verminderen. Daarom is het belangrijk om een gestandaardiseerde maagsondemethode vast te stellen om deze mogelijkheden te verkleinen en te voorkomen dat afkooksel per ongeluk in de slokdarm terechtkomt of slokdarmschade veroorzaakt, wat op zijn beurt de dood van dieren en experimenteel falen veroorzaakt.
Hier kozen we voor de maagsonderoute om de afkookformule in de osteosarcoommodelmuizen af te leveren, omdat het ons in staat stelde de dosering nauwkeurig te meten en een consistente medicijnafgifte gedurende het hele experiment te garanderen. Om de afkookformule te bereiden, berekenden we eerst de hoeveelheid afkookselklare medicijnen voor de muis op basis van een verhouding van 20 keer de hoeveelheid die wordt gebruikt voor volwassenen met een lichaamsgewicht van 60 kg; geweekt en 2x gekookt door te verwarmen tot koken; filter geconcentreerd en bewaarde het afkooksel in aliquots bij -20 °C. Om de maagsonde toe te dienen, laadt u 200 μL van de geconcentreerde afkookformule in een maagsonde, steekt u de maagsondenaald in de mond, duwt u de maagsondenaald voorzichtig naar de maag en injecteert u de afkookformule in de maag van de muis. Een van onze bevindingen is de significante remming van de tumorgroei die wordt waargenomen in de groep die de afkookformule van Yiqi Jiedu-afkooksel via een maagsonde krijgt. We zagen een duidelijke vermindering van het tumorvolume in de Yiqi Jiedu-afkookgroep in vergelijking met de controlegroep. Deze resultaten geven aan dat de maagsondestrategie de actieve componenten van de afkookformule effectief op de doellocatie aflevert, wat resulteert in krachtige antitumoreffecten. Verder evalueerden we het veiligheidsprofiel van de maagsondestrategie door de algemene conditie en het lichaamsgewicht van de muizen gedurende de experimentele periode te monitoren. We vonden geen significante verschillen in veranderingen in lichaamsgewicht of tekenen van toxiciteit tussen de Yiqi Jiedu-afkookselgroep en de controlegroep, wat aangeeft dat de toediening van de afkookformule goed wordt verdragen en geen duidelijke nadelige effecten veroorzaakt.
Hoewel de maagsondestrategie effectief is gebleken bij het toedienen van de afkookformule aan de proefdieren, is het belangrijk om de mogelijke bijwerkingen en bepaalde beperkingen van deze toedieningsmethode te beseffen. Om door voedsel veroorzaakte obstructie van de luchtpijp te voorkomen, moet u de status van de muis tijdens en na de maagsonde nauwlettend in de gaten houden, zoals ademhalingsmoeilijkheden, kortademigheid en hoesten. Zodra een van hen verschijnt, stopt u onmiddellijk de maagsonde en voert u borstcompressies uit op een horizontaal hard bureaublad; Bovendien is onmiddellijke veterinaire hulp noodzakelijk voor elke ernstige aandoening. Bovendien moeten we goed letten op de volgende beperkingen. Ten eerste kan een maagsonde stress veroorzaken bij de dieren, wat mogelijk van invloed is op hun algehele fysiologie en reactie op de behandeling. We hebben echter maatregelen genomen om stress te minimaliseren door een kleine voedingsnaald te gebruiken en de muizen voorzichtig te hanteren tijdens de maagsonde. Bovendien kan een maagsonde alleen worden uitgevoerd door een persoon die specifiek is opgeleid en gekwalificeerd om ervoor te zorgen dat een gestandaardiseerde techniek wordt gebruikt om mogelijke schade aan de dieren te voorkomen14. Ten tweede blijft het exacte mechanisme waarmee de actieve componenten van de afkookformule hun antitumoreffecten uitoefenen onduidelijk. Het is mogelijk dat de maagsondestrategie de farmacokinetiek en farmacodynamiek van de kruidenverbindingen kan veranderen, waardoor hun biologische beschikbaarheid en therapeutische werkzaamheid mogelijk worden beïnvloed. Toekomstige studies moeten zich richten op het ophelderen van de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan de antitumoreffecten van de afkookformule die via een maagsonde wordt toegediend. Bovendien hebben studies gemeld dat toepassing van isofluraananesthesie tijdens langdurige maagsonde de onvolledige inname van afkooksel en de dood van dieren als gevolg van de ongeschoolde maagsondetechniek vermindert15. Ondertussen vermindert het toevoegen van bakolie aan het afkooksel de maagsonde die gepaard gaat met stress bijdieren16.
Tot slot hebben we het gestandaardiseerde afkookproces van Chinese kruiden en de bekwame maagsondestrategie voor muizen geleverd. Deze inspanningen voorkomen niet alleen mogelijke slokdarmverwondingen en de dood van de experimentele muizen, maar voorkomen ook dat het medicijn overloopt en ervoor zorgt dat elk proefdier een gelijke hoeveelheid kruidengeneesmiddelen toedient, waardoor de nauwkeurigheid en consistentie van de experimentele resultaten en ook de therapeutische effecten worden verbeterd. Onze studie toont de werkzaamheid en veiligheid aan van de maagsondestrategie voor toediening van de afkookformule van de traditionele Chinese geneeskunde in een osteosarcoommuismodel. Deze resultaten benadrukken het potentieel van deze toedieningsmethode bij de behandeling van osteosarcoom en leggen de basis voor verder onderzoek naar het optimaliseren van de maagsondestrategie van de toediening van traditionele Chinese geneeskunde. Bovendien moeten toekomstige studies de exacte werkingsmechanismen van de actieve componenten in de afkookformule onderzoeken en mogelijke synergetische effecten met andere behandelingsmodaliteiten onderzoeken om de therapeutische resultaten bij osteosarcoompatiënten te verbeteren. Daarom werpen deze bevindingen licht op de potentiële voordelen en beperkingen van deze toedieningsmethode en bieden ze waardevolle inzichten in de toepassing ervan bij de behandeling van osteosarcoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze niets te onthullen hebben.
Acknowledgments
Het huidige werk wordt ondersteund door subsidies van de (1) National Nature Science Foundation (81973877 en 82174408), (2) National Key R&D Program of China (2020YFE0201600), (3) Shanghai Top Priority Research Center bouwproject (2022ZZ01009), (4) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation, en (5) onderzoeksprojecten binnen het budget van Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | Male | Animal |
| Barbed skullcap herb | Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd. | 20230606 | Decoction-ready medicines |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm) | RWD Life Science Co., Ltd. | C21014-12 | Component of gastric perfusion device |
| Gauze | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | LC45 | Decoction filter |
| Ginseng | Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd. | 20220704-2 | Decoction-ready medicines |
| Hedyotis diffusa | Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd. | 2023071107 | Decoction-ready medicines |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| Rubber bands | Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd. | XPJ | Fixing gauze on the measuring cup |
| Syringe (1 mL ) | Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd. | SBM0040 | Component of gastric perfusion device |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
References
- Gao, S. Discussion on advantages and improvement of traditional Chinese medicine decoction. Chinese Community Physicians (Comprehensive Edition). (21), 12 (2005).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. , (2015).
- An, Y., et al. Interpretation on specification of traditional Chinese medicine decoction. Herald Med. 42 (11), 1648-1652 (2023).
- Chen, S., et al. Research strategies in standard decoction of medicinal slices. China J Chinese Materia Medica. 41 (8), 1367-1375 (2016).
- Luo, F. Effect of soaking traditional Chinese medicine before decoction on active components. Shanghai Yiyao. 40 (9), 63-64 (2019).
- Liu, F., Chen, M. On the standardization of decocting methods of modern decoction. Global Trad Chinese Med. 7 (5), 377-378 (2014).
- Li, X., et al. Influence of decocting times and instrument on the quality of decoction. J Trad Chinese Med. 50 (6), 550-552 (2009).
- Li, X., et al. Herbal decoctosome is a novel form of medicine. Sci China. Life Sci. 62 (3), 333-348 (2019).
- Lan, Y., Hu, Y., Huang, W., Tang, S. Reflections on PK - PD model based on animal experiments for study of Chinese medicine. Lishizen Med Materia Medica Res. 34 (2), 395-397 (2023).
- Li, Y., Bai, M., Song, Y., Guo, H., Miao, M. Research and reflection on standard decoction of Chinese materia medica. Chinese Trad Herbal Drugs. 49 (17), 3977-3980 (2018).
- Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers. , https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/estimating-maximum-safe-starting-dose-initial-clinical-trials-therapeutics-adult-healthy-volunteers (2005).
- Chang, J., et al. Intratibial osteosarcoma cell injection to generate orthotopic osteosarcoma and lung metastasis mouse models. J Vis Exp. (176), 63072 (2021).
- He, C.
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Fronti Pedia. 2, 93 (2014).
- Jones, C. P., Boyd, K. L., Wallace, J. M. Evaluation of mice undergoing serial oral gavage while awake or anesthetized. J Am Assoc Lab Animal Sci. 55 (6), 805-810 (2016).
- Recena Aydos, L., et al. Nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet in C57bl/6 models. Nutrients. 11 (12), 3067 (2019).
