Lesão neural induzida por laser de dois fótons: um método para observar a degeneração e regeneração do Axônio em Larvas de Drosophila

Overview

Este vídeo descreve ablação a laser de dois fótons de axônios em uma larva de melanogaster Drosophila e um protocolo de exemplo para induzir lesões e imagem do local da lesão.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Li et al., A Drosophila In Vivo Injury Model for Study Neuroregeneration in the Perif periférico and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018).

1. Lesão de dois fótons e imagem confocal

1. Configuração do microscópio
   NOTA: Um microscópio de varredura a laser confocal com um laser de dois fótons foi usado para este experimento, mas outros sistemas com uma configuração equivalente também serão suficientes. O laser de dois fótons (930 nm) foi usado para a entrega de lesões e um laser de Argon (488 nm) foi usado para imagens confocal de GFP.
   1. No início de cada sessão, ligue o laser de dois fótons e/ou o laser confocal e o microscópio. Abra o software de imagem.
   2. Para lesão de dois fótons, configure os seguintes parâmetros para a imagem de GFP com o laser de dois fótons a 930 nm (1.950 mW).
      1. Selecione o modo de varredura de linha. Abra o buraco todo o caminho. Aumente a intensidade do laser para ~20% (390 mW).
      2. Selecione 512 x 512 como a varredura do quadro. Use velocidade máxima de varredura (normalmente com o tempo de habitação do pixel em 0,77 μs). Certifique-se de que o número médio é de 1 e a profundidade de bits é de 8 bits.
      3. Definir ganho para ~750, e o deslocamento para 0.
      4. Salve este protocolo experimental pré-definido como Ablação 2P GFP 930,permitindo fácil reutilização em experimentos futuros.
   3. Para imagens confocal, configure os seguintes parâmetros para imagem GFP com o laser argon a 488 nm:
      1. Selecione a guia Aquisição e, em seguida, pilha de Z.
      2. Em "Laser", ligue a potência para o laser argon de 488 nm.
      3. Vá para canais,selecione o laser de 488 mm e aumente a potência do laser para 5-10%. Para o orifício, use a unidade arejada 1-2 (UA). Ajuste o ganho para 650.
      4. No Modo de Aquisição,selecione 1024 x 1024 como a varredura do quadro, use a velocidade máxima de varredura, um número médio de 2 e profundidade de bit de 8 Bits.
      5. Salve este protocolo experimental pré-definido como GFP Imaging.
2. Anestesia larva com éter dietil e montagem
   1. Em um capô de fumaça, coloque uma placa de vidro de 60 mm em uma placa de Petri de plástico de 15 cm. Dobre e coloque um pedaço de papel de tecido na parte inferior do prato de vidro, em seguida, coloque uma placa de ágar suco de uva sobre o tecido. Adicione éter dietil no prato de vidro, ao ponto em que o papel de tecido está encharcado e há uma camada de éter líquido restante no prato. Mantenha a tampa ligada o tempo todo.
   2. Prepare uma lâmina de vidro com uma gota de óleo de halocarboneto 27 no centro. Adicione 4 pontos de graxa de vácuo nos quatro cantos do slide, para posteriormente suportar a mancha de cobertura.
   3. Use fórceps para pegar uma larva limpa e colocá-la na placa de ágar na placa de vidro de 60 mm. Cubra o prato de vidro com sua tampa e espere até que a larva pare de se mover. Para lesões/imagens PNS, tire a larva assim que sua cauda parar de se contrair. Para o CNS, espere até que toda a larva fique imóvel, especialmente os segmentos da cabeça.
      NOTA: O tempo de exposição ao éter é crítico. Veja discussão.
   4. Pegue cuidadosamente a larva anestesiada e coloque-a de cabeça erguida na gota de óleo de halocarbono na lâmina. Adicione uma mancha de cobertura em cima do slide. Use pressão suave para empurrar para baixo sobre a mancha de cobertura, até que toque na larva(Figura 1A).
   5. Ajuste a posição da larva empurrando suavemente a mancha de cobertura em direção à esquerda ou à direita para rolar a larva, de modo que o neurônio/axônio/dendrite de interesse esteja no topo e mais próximo da lente do microscópio.
   6. Para lesão PNS, monte o lado dorsal da larva para cima, de modo que ambas as traqueias sejam visíveis. Em seguida, role a larva ~30 graus à esquerda para ferir os axônios da classe III do neurônio(Figura 1B e 1C), 90 graus para ferir a classe IV dos axônios neurônios(Figura 1B e 1E), ou ~30 graus para ferir a classe IV da dendrito do neurônio(Figura 2A).
   7. Para lesão cns, posicione a larva para cima perfeitamente ventral(Figura 3A),de modo que a região de interesse esteja mais próxima da lente do microscópio no plano z.
3. Lesão por laser de dois fótons
   1. Coloque o slide com a larva sob o microscópio e fixe-o no lugar com o porta-slides no palco. Use o objetivo 10X (0.3 NA) para encontrar a larva.
   2. Adicione 1 gota de óleo objetivo no deslizamento de tampas, mude para o objetivo 40X (1.3 NA) e ajuste o foco.
   3. Mude para o modo de digitalização e reutilize o protocolo experimental 2P GFP 930 Ablaation. Certifique-se de que o orifício está aberto o tempo todo.
      NOTA: A configuração precisa ser otimizada com base em sistemas individuais.
   4. Inicie o modo Live para localizar a região de interesse (ROI) e ajuste as configurações para obter uma boa qualidade de imagem com o zoom apropriado.
      NOTA: O objetivo deste passo é encontrar o neurônio/axônio/dendrite para ferir, em vez de tirar a melhor imagem de qualidade. Portanto, use as configurações mínimas suficientes para visualizar a área alvo, a fim de evitar superexposição ou fotobleaching.
   5. Pare a varredura ao vivo, de modo que o botão Crop fique disponível. Deixe a imagem parada servir como o roteiro. Selecione a função Crop e ajuste a janela de varredura para focar no alvo a ser ferido.
   6. Reduza o ROI para ser o tamanho do local potencial da lesão. Por exemplo, basta cobrir a largura de um axônio ou um dendrite, para garantir a precisão da lesão e reduzir os danos aos tecidos vizinhos. Se desejar, amplie o ROI antes de cortar, permitindo uma lesão mais precisa.
   7. Abra uma nova janela de imagem. Reduza a velocidade do scan e aumente a intensidade do laser. Determine o aumento da intensidade do laser com base no sinal de fluorescência tecidual escaneado no modo Live.
   8. Normalmente, defina a intensidade do laser de dois fótons a partir de 25% para lesão PNS e 50-100% para lesão VNC. Para lesão de axônio PNS, certifique-se de que a intensidade do laser é de ~480 mW e o tempo de moradia dos pixels é de 8,19 μs. Para a lesão do axônio VNC, certifique-se de que a intensidade do laser e o tempo de moradia dos pixels são geralmente 965-1930 mW e 8,19-32,77 μs, respectivamente.
   9. Inicie a varredura contínua. Deixe o cursor pairando sobre o botão Contínuo. Fique de olho na imagem e pare a varredura assim que for observado um aumento drástico da fluorescência.
      NOTA: O aparecimento do pico de fluorescência é devido à auto-fluorescência no local da lesão.
   10. Volte para o modo Live reutilizando as configurações. Encontre a região de interesse que foi apenas alvo ajustando o foco.
       NOTA: Uma boa indicação de ferimentos bem sucedidos é o aparecimento de uma pequena cratera, estrutura semelhante a um anel, ou detritos localizados bem no local da lesão.
   11. Mova-se para o próximo neurônio e repita a partir do passo 1.3.5, para ferir múltiplos neurônios em um único animal. Ou repita o passo 1.3.5 enquanto aumenta gradualmente a potência e/ou reduz a velocidade de varredura se a lesão inicial fosse insuficiente.
       NOTA: No caso de a potência do laser ser muito alta, uma grande área danificada será visível na imagem de varredura ao vivo pós-lesão. Muita lesão pode causar a morte da larva.
   12. Recupere a larva removendo cuidadosamente o deslizamento e transferindo a larva ferida para uma nova placa com pasta de levedura. Despeje várias cavernas na placa de ágar com fórceps; alternativamente, faça uma ilha de ágar na placa em vez de usar toda a placa, para reduzir a possibilidade da larva rastejando para fora da placa.
   13. Coloque a placa em uma placa de Petri de 60 mm com tecido molhado (encharcada com solução de ácido propiônico de 0,5%) e cultura em temperatura ambiente ou 25 °C.
       NOTA: A larva permanecerá no estágio larval por aproximadamente um dia extra a temperatura ambiente (22 °C) em comparação com 25 °C.
4. Imagem confocal pós-lesão
   1. Imagem a larva ferida nos pontos de tempo desejados, preparando a larva usando o mesmo procedimento de anestesia e montagem como na Etapa 1.2, em seguida, imagem com o laser confocal.
      NOTA: Imagem da larva às 24h após a lesão (IA) para confirmar lesão axal e a 48 h de IA (classe IV dos neurônios) ou 72 h AI (classe III dos neurônios) para avaliar a regeneração.
   2. Localize a larva usando o objetivo 10X e mude para um objetivo de 25X (0,8 NA). Reutilizar o protocolo experimental GFP Imaging.
   3. Clique no botão Viver e encontre o mesmo neurônio ferido anteriormente.
   4. Defina a primeira e última posição Z na janela de varredura ao vivo. Pressione stop e clique em Iniciar o experimento para adquirir uma imagem de pilha Z.
      NOTA: Certifique-se de que um ponto de normalização (o ponto convergente do axônio) seja incluído ao capturar imagens para que a quantificação da regeneração seja possível (Figura 1D, 1F) – isso é discutido mais adiante na seção de análise de dados.
   5. Mude para Processamento de Imagem,selecione a imagem apenas tirada e gere uma projeção de intensidade máxima. Salve as imagens de projeção z-stack e de intensidade máxima.

Representative Results

Figura 1: A regeneração do axônio do neurônio na periferia mostra especificidade de classe. (A e B) Desenho esquemático mostrando a posição das larvas. (C) Desenho esquemático da classe III dos neurônios. (D) Axônios da classe III da neurônios ddaF, rotulados com 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, não conseguem voltar a crescer. (E) Desenho esquemático da classe IV dos neurônios. (F) Axônios da classe IV dos neurônios v'ada, rotulados com ppk-CD4-tdGFP/+, recrescem além do local da lesão. (D e F) A linha vermelha indica o comprimento do axônio, enquanto a linha verde tracejada marca a distância entre o corpo celular e o ponto convergente do axônio (DCAC). O ponto azul marca o ponto convergente do axônio. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Regeneração de dendrite do neurônio. (A) Representação ilustrativa dos neurônios classe IV. (B) Representação ilustrativa da regeneração de dendrito na classe IV da neurônio ddaC, rotulada por ppk-CD4-tdGFP/+. A ablação a laser é direcionada ao ponto do ramo primário e é conduzida a 48 h AEL. Às 24 h é confirmada a transeção de lesão da lesão de IA do neurite, e a regeneração de IA de 72 h é quantificada. Dendritos de neurônios ddaC demonstram um crescimento substancial, com novos ramos dendráticos brotando da haste decepada para ladrilho o espaço vago. Vale ressaltar que novas filiais terminais são continuamente adicionadas aos dendritos não feridos nesta fase de desenvolvimento. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Regeneração do axônio do neurônio no VNC. (A) Desenho esquemático de uma larva de Drosophila montada em um slide e imagem sob o microscópio. Axônios de neurônio classe IV no VNC visualizados em uma larva ppk-CD4tdGFP/+ Dois segmentos de comissura candidato são mostrados na imagem ampliada e no desenho esquemático. Cada um deles tem dois locais de lesão (círculos vermelhos). (B) Imagens confocal de um segmento ferido imagens em 8, 24 e 72 h após lesão (IA). Linhas vermelhas retratam os axônios de regrowing. (C) Medição e normalização de axônios de regrou. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent