Summary
Protokollen beskriver håret rodinduktion ved hjælp af Arabidopsis primære blomsterstængler og Brassica napus hypocotyls. De hårede rødder kan dyrkes og bruges som explants til at regenerere transgene planter.
Abstract
Behåret rodtransformation repræsenterer et alsidigt værktøj til plantebioteknologi i forskellige arter. Infektion med en Agrobacterium-stamme , der bærer et rodinducerende (Ri) plasmid, inducerer dannelsen af hårede rødder på sårstedet efter overførsel af T-DNA fra Ri-plasmidet til plantegenomet. Protokollen beskriver detaljeret proceduren for injektionsbaseret hårrodsinduktion i Brassica napus DH12075 og Arabidopsis thaliana Col-0. De hårede rødder kan bruges til at analysere et transgen af interesse eller behandles til generering af transgene planter. Regenereringsmedium indeholdende cytokinin 6-benzylaminoturin (5 mg / l) og auxin 1-naphthaleneddikesyre (8 mg / l) fremkalder med succes skuddannelse i begge arter. Protokollen omfatter genotypebestemmelse og udvælgelse af regeneranter og T1-planter for at opnå planter, der bærer et transgen af interesse og fri for T-DNA fra Ri-plasmidet. En alternativ proces, der fører til dannelsen af en sammensat plante, er også afbildet. I dette tilfælde holdes hårede rødder på skuddet (i stedet for de naturlige rødder), hvilket muliggør undersøgelse af et transgen i hårede rodkulturer i sammenhæng med hele planten.
Introduction
Plantetransformation er flaskehalsen for enhver genetisk undersøgelse inden for plantebiologi. En jordbåren bakterie, Agrobacterium tumefaciens, anvendes i vid udstrækning som et middel til genlevering ved blomsterdip eller vævskultur til at generere transformanter. A. tumefaciens inficerer planter på et sårsted og forårsager tumorer på grund af overførsel og integration af T-DNA fra et tumorinducerende (Ti) plasmid i værtsplantegenomet. Manipulerede A. tumefaciens-stammer med modificeret Ti-plasmid uden vildtype T-DNA og en binær vektor med kunstigt T-DNA og kloningssteder til indsættelse af et gen af interesse anvendes almindeligvis som et effektivt plantetransformationssystem1. Imidlertid er mange modelarter og afgrøder genstridige over for blomsterdip eller in vitro plantegenerering eller har lange vækstcyklusser, hvilket påvirker effektiviteten af dette transformationssystem.
Agrobacterium rhizogenes inducerer dannelsen af utilsigtede rødder eller hårede rødder på sårstedet efter infektion af en værtsplante. I lighed med A. tumefaciens overfører A. rhizogenes et T-DNA fra et rodinducerende (Ri) plasmid til værtsplantegenomet, hvilket forårsager udvikling af transgene hårede rødder. Denne proces styres hovedsageligt af rodonkogene loci (rol) gener 2,3. Ved hjælp af agrobakterielle stammer, der bærer både Ri-plasmidet og en kunstig binær vektor, der koder for et gen af interesse, er hårede rodkulturer blevet brugt til at producere rekombinante proteiner, analysere funktionen af promotorer eller gener eller redigere genomer ved hjælp af Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRS) / CRISPR-associeret protein 9 (Cas9) 4,5,6.
Vores protokol bruger den transkonjugante stamme Ti-less A. tumefaciens C58C1, der bærer Ri-plasmidet pRiA4b7. Ri-plasmidets T-DNA består af to regioner, højre og venstre T-DNA (HENHOLDSVIS TR-DNA og TL-DNA), der uafhængigt kan integreres i plantegenomet8. Ved at udnytte dette system blev den langvarige explant-transformationsproces i Brassica napus DH12075 sort optimeret9. Protokollen beskrevet nedenfor giver mulighed for regenerering af udvalgte hårede rodlinjer og opnåelse af T1-planter, der bærer transgenet af interesse og fri for rolgener på cirka 1 år. Den injektionsbaserede hårede rodtransformation kan bruges i andre Brassicaceae-arter, som vist ved at transformere Arabidopsis thaliana Col-0. Mens hypocotyl bruges til at omdanne B. napus, injiceres A. thaliana i den primære blomsterstandstamme.
Protocol
1. Fremstilling af medier og opløsninger
- Forbered hormonstamopløsningerne.
- Til fremstilling af 50 ml 1-naphthaleneddikesyre (NAA), 6-benzylaminoturin (BAP) og indol-3-smørsyre (IBA) stamopløsning med en koncentration på 5 mg/ml opløses 250 mg pulveriseret hormon i 2 ml 1 M natriumhydroxid (NaOH) og volumen justeres til 50 ml med ultrarent vand.
- For at fremstille 50 ml gibberellinsyre (GA3) med en koncentration på 1 mg / ml opløses 50 mg pulveriseret hormon i 2 ml ethanol og justeres volumenet til 50 ml ultrarent vand.
- Opløsningen filtreres ved hjælp af et sterilt sprøjtefilter med en porestørrelse på 0,22 μm og fordeles i sterile 2 ml tuber til opbevaring. Opbevar opløsningen ved -20 °C eller 4 °C, afhængigt af producentens anbefaling.
- Forbered antibiotikaopløsninger. For 50 ml cefotaxim og ticarcillindinatriumstamopløsning med en koncentration på 100 mg/ml opløses 0,5 g af det pulveriserede antibiotikum i 40 ml ultrarent vand og justeres til et slutvolumen på 50 ml. Opløsningen filtreres ved hjælp af et sterilt sprøjtefilter med en porestørrelse på 0,22 μm og fordeles i sterile 2 ml tuber til opbevaring. Opbevar opløsningen ved -20 °C.
BEMÆRK: Antibiotika og hormoner tilsættes altid til det afkølede medium. - Forbered 1 liter Luria Broth (LB) medium ved at tilsætte 10 g bacto-trypton, 5 g gærekstrakt og 5 g natriumchlorid (NaCl) i et 1 L måleglas og juster volumen til 1 liter med dobbeltdestilleret vand. Juster pH til 7,0 med KOH med en pH-meter (følg producentens anvisninger). Opløsningen overføres til en 1 L flaske og tilsættes 15 g bakteriologisk agar (1,5%), hvis der fremstilles et fast medium, og autoklave mediet. Tilsæt om nødvendigt de passende antibiotika (bakteriel resistens bæres på den binære vektor) til det afkølede medium.
BEMÆRK: Brug en autoklave til at sterilisere opløsningen. Sæt flasken i kurven, luk låget og steriliser det i 20 minutter ved 121 °C og 98,9 kPa. Denne protokol bruges altid til autoklavering af løsninger i yderligere trin. - Forbered 1 l gærekstrakt oksekød (YEB) medium ved at blande 5 g oksekødekstrakt, 1 g gærekstrakt, 5 g pepton, 5 g saccharose og 0,5 g magnesiumchlorid (MgCl2) i dobbeltdestilleret vand. Indstil lydstyrken til 1 L. Overfør opløsningen til en 1 L flaske. Autoklave mediet.
- Forbered 1 liter medium til frøspiring ved at blande 2,2 g Murashige og Skoog (MS) pulver, 10 g saccharose (1%) og 0,5 g 2-(N-Morpholino) ethansulfonsyre (MES) natriumsalte i dobbeltdestilleret vand. Juster lydstyrken til 1 L, bland, og juster pH til 5,8 med KOH. Overfør opløsningen til en 1 L flaske og tilsæt 8 g planteagar (0,8%). Autoklave mediet.
- Forbered 1 liter plantevækstmedium ved at blande 2,2 g MS-pulver, 5 g saccharose (0,5%) og 0,5 g MES-salte i dobbeltdestilleret vand. Juster lydstyrken til 1 L, bland, og juster pH til 5,8 med KOH. Opløsningen overføres til en 1 liter flaske og tilsættes 8 g planteagar (0,8%). Autoklave mediet.
- Forbered 1 liter håret rodvækstmedium ved at blande 4,4 g MS + B5 vitaminpulver, 30 g saccharose (3%) og 0,5 g MES-salte i dobbeltdestilleret vand. Juster lydstyrken til 1 L, bland og juster pH til 5,8 med KOH, og overfør opløsningen til en 1 L flaske. Tilsæt 3 g geleringsmiddel (0,3%) og autoklave mediet. Der tilsættes cefotaxim og ticarcillindinatrium til en slutkoncentration på henholdsvis 100-200 mg/l og 100-500 mg/l. Tilsæt om nødvendigt de relevante antibiotika (resistens skyldes T-DNA af en binær vektor).
- Forbered 1 liter sammensat plantevækstmedium ved at blande 2,2 g MS + B5 vitaminpulver, 10 g saccharose (1%) og 0,5 g MES-salte i dobbeltdestilleret vand. Juster lydstyrken til 1 L, bland og juster pH til 5,8 med KOH og overfør opløsningen til en 1 L flaske. Tilsæt 6 g geleringsmiddel (0,6%) og autoklave mediet. Der tilsættes cefotaxim og ticarcillindinatrium til en slutkoncentration på henholdsvis 200 mg/l og 500 mg/l. Tilsæt om nødvendigt de relevante antibiotika (resistens skyldes T-DNA af en binær vektor).
- Forbered 1 liter regenereringsmedium ved at blande 4,4 g MS + B5 vitaminpulver, 30 g saccharose (3%) og 0,5 g MES-salte i dobbeltdestilleret vand. Juster lydstyrken til 1 L, bland, og juster pH til 5,8 med KOH. Opløsningen overføres til en 1 liter flaske og tilsættes 3 g geleringsmiddel (0,3%). Autoklave mediet. Der tilsættes NAA og BAP til en slutkoncentration på henholdsvis 8 mg/l og 5 mg/l og ticarcillindinatrium til en slutkoncentration på 100 mg/l.
- Forbered 1 liter skudforlængelsesmedium ved at blande 4,4 g MS + B5 vitaminpulver, 20 g saccharose (2%) og 0,5 g MES-salte i dobbeltdestilleret vand. Juster lydstyrken til 1 L, bland, og juster pH til 5,8 med KOH. Overfør opløsningen til en 1 L flaske og tilsæt 3 g planteagar (0,3%). Autoklave mediet. Der tilsættes BAP og GA3 til en slutkoncentration på henholdsvis 0,5 mg/l og 0,03 mg/l og cefotaxim til en slutkoncentration på 100 mg/l.
- Forbered 1 liter rodinduktionsmedium ved at blande 2,2 g MS + B5 vitaminpulver, 10 g saccharose (1%) og 0,5 g MES-salte i dobbeltdestilleret vand. Juster lydstyrken til 1 L, bland, og juster pH til 5,8 med KOH. Overfør opløsningen til en 1 L flaske og tilsæt 3 g geleringsmiddel (0,3%). Autoklave mediet. Der tilsættes IBA og cefotaxim til en slutkoncentration på henholdsvis 0,5 mg/l og 100 mg/l.
- Der fremstilles 1 liter Cetyltrimethylammoniumbromid-buffer (CTAB) ved tilsætning af 20 g CTAB (2 % w/v endelig), 100 ml 1M Tris-HCl, pH 8,0 (100 mM endelig), 40 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 (20 mM endelig), 81,8 g NaCl (1,4 M endelig) og 5 g PVP40 (0,5 % w/v endelig). Juster til 1 liter med dobbeltdestilleret vand. Autoklave løsningen. Opbevar opløsningen i op til 1 år ved stuetemperatur.
2. Transformation af Agrobacterium med en binær vektor
- Forbered DNA'et fra et verificeret binært plasmid indeholdende T-DNA-kassetten, der skal integreres i plantegenomet. Sørg for, at plasmid-DNA'et indeholder lave salte for at undgå elektriske gnister, når der anvendes elektroporation. Det anbefales at bruge et valgt plasmid-DNA-ekstraktionssæt.
- Forbered elektrokompetente Agrobacterium tumefaciens C58C1-celler, der indeholder det hårrodsinducerende plasmid pRiA4b ved at inokulere 200 ml væske forvarmet (28 °C) YEB med 8 ml frisk kultur natten over. Der inkuberes kultur ved 28 °C under omrystning, indtil den optiske massefylde ved 600 nm (OD600) er ca. 0,5, svarende til den midterste logaritmiske fase. Det tager cirka 4 - 5 timer.
- Opdel Agrobacterium-kulturen i fire forkølede sterile 50 ml centrifugerør. Der centrifugeres i 15 minutter ved 4 °C ved 3.200 x g.
BEMÆRK: Cellerne skal holdes kolde fra dette trin og fremefter. - Supernatanten fjernes og pellets resuspenderes forsigtigt i (4x) 2,5 ml kold (4 °C) 10% glycerol. Tilsæt yderligere 47,5 ml kold 10% glycerol og bland forsigtigt.
- Pilleceller ved 3.200 x g i 15 minutter ved 4 °C. Supernatant kasseres og resuspenderes i (4x) 10 ml kold 10% glycerol.
- Pellet cellerne igen og resuspender dem i (4x) 0,75 ml kold 10% glycerol. Saml indholdet af alle fire rør i ét (samlet volumen = 3 ml).
- Opdel den agrobakterielle opløsning i 50 μL alikvoter i forkølede sterile 1,5 ml mikrorør. Alikvoterne fryses på tøris eller flydende nitrogen. Opbevar rørene ved -80 °C til fremtidig brug.
- Et rør med kompetente celler (50 μL) anbringes på is, blandes med 5 μL plasmid-DNA (1 μg i alt fra trin 2.1), blandingen overføres til en elektroporationskuvette (0,2 cm mellemrum), og inkuberes i 5 minutter på is.
- Placer kuvetten i elektroporatoren og elektroporat cellerne med følgende indstillinger: kapacitans 25 μFD, modstand 400 Ω, elektrisk spænding 2,5 kV, pulsvarighed 9,7 ms.
- Der tilsættes 950 μL flydende LB-medium til cellerne, som derefter dyrkes ved 28 °C i 2 timer ved 300 omdr./min. i en termomixer. Plade 50 μL af cellekulturen på et fast LB-medium med det passende selektive antibiotikum. Pladerne dyrkes i 2 dage ved 28 °C.
BEMÆRK: Det anbefales at plade en række cellekulturer (10 μL - 100 μL) pr. plade for at bestemme et korrekt dyrkningsvolumen og undgå overvækst af bakterier. - Forbered flydende kulturer fra nogle få udvalgte kolonier i 5 ml LB flydende medium med antibiotika. Dyrk bakterierne natten over ved 28 °C under omrystning. Brug disse kulturer til glycerollagre ved at blande 0,5 ml flydende bakteriekultur og 0,5 ml 40% glycerol.
BEMÆRK: Disse kolonier verificeres for tilstedeværelsen af transgenet ved koloni-PCR. Til dette formål tilsættes en lille mængde af en koloni fra en plade til PCR-masterblandingen indeholdende buffer, dNTP og Taq-polymerase efter eget valg sammen med primere, der forstærker en del af T-DNA'et fra en binær vektor. Inokulum fra glycerollagrene anvendes til omdannelse af planterne.
3. Behåret rodtransformation af Brassica napus DH12075
- Placer frø af Brassica napus DH12075 i mikrorør og steriliser dem i en flowboks. Affedt først frøene med vand og 0,1% vaskemiddel, mens du ryster i 60 s. Skyl derefter frøene med vand efterfulgt af 70% ethanol, begge i 60 s.
- Steriliser frøene ved hjælp af en 10% opløsning af kommercielt blegemiddel indeholdende natriumhypochlorit. Ryst frøene i denne opløsning i 20 min.
- Vask frøene 4x med sterilt vand i 60 s hver. Placer dem på petriskåle, der indeholder frøspiringsmediet. Frøene koldstratificeres ved 4 °C natten over, og pladerne flyttes til et dyrkningsrum (21 °C, 16 timer lys/8 timer mørkt).
- Overfør 5 dage gamle frøplanter til plantekulturkasser, der indeholder et plantevækstmedium .
BEMÆRK: Den bedste transformationseffektivitet i DH12075 blev identificeret for 18 dage gamle frøplanter. Frøplantealderen kan optimeres til de lokale vækstbetingelser eller andre sorter. - Inokulere en flydende kultur af Agrobacterium tumefaciens C58C1 , der bærer et behåret rodinducerende plasmid pRiA4b og den binære vektor til transformation (fra trin 2.11) med en podningssløjfe. Brug 5 ml LB-medium. Dyrk denne kultur natten over ved 28 ° C, indtil den når OD600 = 0,9 - 1.
BEMÆRK: Agrobakterie, der kun indeholder Ri-plasmidet, anvendes, hvis der produceres vildtypehårede rødder. - Injicer en lille mængde kultur (ca. 50 μL) med en insulinsprøjte i hypocotyl af en 18 dage gammel frøplante (fra trin 3.4.). Punktering hypocotyl igennem med en 26G nål monteret på sprøjten ca. 1 cm over mediets overflade. Injicer væsken i såret. Vævet på overfladen af hypocotyl kan også ridses af sprøjten.
BEMÆRK: Antallet af podede frøplanter skal tilpasses eksperimentatorens behov. - Sæt planterne tilbage i dyrkningsrummet ved 21 °C i 2 til 4 uger, indtil der dannes hård hud og hårede rødder på sårstedet.
- Afskær callus med de fremkomne hårede rødder fra hypocotyl og læg den på en petriskål med det hårede rodvækstmedium indeholdende selektive antibiotika (båret af T-DNA) og cefotaxim (200 mg / L) og ticarcillin (500 mg / L) for at undertrykke agrobakteriel vækst. Forsegl petriskålene med gasgennemtrængeligt tape. Dyrk de behårede rødder ved 24 °C i mørke.
BEMÆRK: Korrekt koncentration af specifikke antibiotika, der anvendes til funktionel udvælgelse, skal testes med vildtypehårede rødder. Til B. napus DH12075 hårede rødder, der bærer resistens over for kanamycin, anvendes en koncentration på 25 mg/l kanamycin.
BEMÆRK: I dette trin er det muligt at generere en sammensat plante bestående af vildtypeskud og transgene hårrødder, der understøtter væksten af en sådan plante. I stedet for at afskære de hårede rødder fra en stilk, fjernes plantens oprindelige rødder. Planten med nye hårede rødder overføres til en plantekulturkasse med et sammensat plantevækstmedium indeholdende cefotaxim (200 mg / L) og ticarcillin (500 mg / L) for at undertrykke agrobakteriel vækst og det selektive antibiotikum (båret af T-DNA). - Efter 1 - 2 uger isoleres de hårede rødder på petriskålen fra callus og individualiseres dem på tallerkener med samme kulturmedium. Overfør kulturen til en frisk tallerken hver 4. til 5. uge. Tilsæt 0,25 mg / L IBA for at øge rodforgreningen.
- Koncentrationerne af cefotaxim og ticarcillin reduceres gradvist ved hver overførsel med 100 mg/l (dvs. substratet for den første overførsel indeholder 100 mg/l cefotaxim og 400 mg/l ticarcillin; for den anden overførsel 300 mg/l ticarcillin osv.). Efter 3 - 4 måneder dyrkes de behårede rødder på et behåret rodvækstmedium med 100 mg/L ticarcillin og det selektive antibiotikum.
4. Regenerering af Brassica napus DH12075 behårede rødder
- Overfør uafhængige hårede rodlinjer til plader med regenereringsmedium under sterile forhold ved hjælp af pincet, flammet før brug. Overfør 5 - 10 rødder pr. petriskål og dyrk dem ved 21 °C i en lang dags fotoperiode (16 timer lys / 8 timer mørk). Forsegl petriskålene med gasgennemtrængeligt tape.
- Hver 3. til 4. uge overføres de hårede rødder til plader med frisk regenereringsmedium. Bemærk, at calli dannes efter ca. 2 uger. Callus begynder at skyde efter yderligere 2 uger til indtil 8 - 9 uger efter callus dannelse.
- Individualiser skuddene og overfør dem til plantekulturkasser med skudforlængelsesmedium i 2 til 3 uger for at fremme forlængelsen af skuddene.
- Overfør de aflange skud til plantekulturkasser med et rodinduktionsmedium. Opdater kulturen hver 3. - 4. uge. Rooting effektiviteten i DH12075 er 87% efter 30 dage og op til 100% efter 60 dage.
- Overfør de rodfæstede planter til jorden efter fjernelse af spor af geleringsmiddel for at forhindre svampeinfektion. Sørg for, at planterne først akklimatiseres i phytotronerne (21 ° C, langdagsfotoperiode, 150 μE) og overfør dem derefter til et drivhus til blomstring (21 ° C / 18 ° C, langdagsfotoperiode, 150 μE).
5. Valg af regenerant og T1-plante
BEMÆRK: De hårede rodlinjer kan vælges, før de går ind i regenereringsprocessen. Typen af udvælgelse afhænger af indholdet, der bæres af transgenet. De hårede rødder kan udtages til DNA-ekstraktion og genotype- eller mutationsdetektion, RNA-ekstraktion med efterfølgende cDNA-syntese og RT-qPCR til ekspressionsniveauanalyse af det valgte gen, mikroskopi til fluorescensdetektion eller behandles for GUS-farvning.
- Efter overførsel til jord genotypes de regenererende T0-planter (og T1-frøplanter) igen for at undgå, at de undslipper udvælgelsesprocedurerne. T0-planter udviser en ændret fænotype kaldet Ri-fænotype: omfattende rodvækst, krøllede blade og dværgskud forårsaget af tilstedeværelsen af TL og / eller TR-DNA fra Ri-plasmidet indsat i plantegenomet.
- For at fremskynde T1-udvælgelsen skal du bruge frø, der indeholder grønne modne embryoner (ca. 21 - 28 dage efter bestøvning til DH12075 for et torpedofæg eller ældre) fra T0-regenererende planter til embryoredning.
- Arbejd i den sterile flowboks. Saml siliquerne og overfladesteriliser dem med 70% ethanol.
- Placer dem på et dobbeltsidet tape tapet på et pladelåg eller et dias.
- Brug en stereokikkert til at skære silique langs ventilkanterne ved hjælp af en 26G nål. Sørg for, at snittet ikke beskadiger frøene. For at få et let greb skal nålen monteres på en 1 ml sprøjte.
- Åbn carpels og hold dem til båndet. Saml de umodne frø og overfør dem til plader med medium til frøspiring. Forsegl pladerne med gasgennemtrængeligt tape.
- Pladerne anbringes i et dyrkningsrum (21 °C, 16 timer lys/8 timer mørkt) indtil spiring.
- Genotype T1-frøplanterne for tilstedeværelse af det pågældende transgen og fravær af Ri TR/TL (figur 1). Saml bladmateriale og ekstraher deres DNA ved hjælp af den valgte metode. CTAB-metoden er beskrevet her:
- Saml bladmaterialet i et 2 ml mikrorør indeholdende to keramiske perler. Frys røret i flydende nitrogen.
- Slib materialet ved hjælp af en kuglemølle. Alternativt kan stød og mørtel anvendes.
- Efter en hurtig centrifugering tilsættes 400 μL CTAB-buffer til pulveret. Vortex kort, spin ned og inkuber ved 60 ° C i mindst 50 minutter.
- Afkøl opløsningen til stuetemperatur i 15 min. Tilsæt et volumen chloroform og bland forsigtigt.
FORSIGTIG: Når du bruger chloroform, skal du arbejde under kemikaliestrømmen og bruge handsker til beskyttelse. Enhver opløsning, der indeholder chloroform, skal kasseres i den relevante affaldsspand. - Centrifuger i 5 minutter ved 18.400 x g ved hjælp af en bordcentrifuge. 250 - 350 μL af den øvre vandige fase overføres til et nyt mikrorør. Udelad interfasen.
- Tilsæt et volumen isopropanol, bland godt og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. Centrifuger i 40 min ved 18.400 x g.
- Kassér væsken og tilsæt 200 μL 70% ethanol. Vask pillen og centrifuger i 15 min ved 18.400 x g.
- Kassér væsken. Lufttør pillen og tilsæt 50 - 100 μL ultrarent vand. Lad DNA'et opløses i 1 time til natten over i køleskabet.
- Udfør en genotypning ved PCR for rolA-genet (TL), aux1-genet (TR) og virC-locus (Agrobacterium). Forbered PCR-reaktionen ved hjælp af det fremstillede DNA (fra trin 5.3.), primere, buffer, dNTP og Taq-polymerase i henhold til producentens protokol. De forstærkede fragmenter er 200 - 500 bp lange.
Primere specifikt til rolA:
Fremad: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAG
Baglæns: TGCGTATTAATCCCGTAGGTC
Primere specifikt til aux1:
Fremad: CATAGGATCGCCTCACAGGT
Baglæns: CGTTGCTTGATGTCAGGAGA
Primere specifikt for virC:
Fremad: AATGCGTCTCTCTCGTGCAT
Baglæns: AAACCGACCACTAACGCGAT
BEMÆRK: T-DNA-overførsel og integration kan være delvis, og kun dele af TL og / eller TR kan integreres i genomet. Det anbefales således at analysere tilstedeværelsen af andre ORF'er af TL (fx rolB og rolC) og TR (aux2, mas1, ags1) i T1-frøplanter. Primersekvenser, der er specifikke for disse loci, er anført i Jedličková et al.9. - Evaluer PCR-reaktioner ved gelelektroforese.
BEMÆRK: Det anbefales at inkludere en positiv kontrol i denne analyse for at sikre at have DNA af PCR-kvalitet. - Vælg for tilstedeværelsen (eller fraværet) af transgenet i henhold til protokollerne baseret på indholdet af dette transgen.
- Overfør udvalgte frøplanter til jorden.
6. Behåret rodtransformation og regenerering i Arabidopsis thaliana Col-0
- Overfladesteriliser A. thaliana frø med en metode efter eget valg (blegemiddel, ethanol eller klorgas).
- Plade sterile frø på et medium til frøspiring. Efter 2 dages kold stratificering flyttes pladerne til et dyrkningsrum (21 ° C med lang fotoperiode og 50% fugtighed).
- Overfør 1 uge gamle frøplanter til en plantekulturkasse med plantevækstmedium.
- Forbered Agrobacterium-kulturer som angivet i trin 3.5.
- Injicer en lille mængde kultur (ca. 50 μL) med en nål monteret på en insulinsprøjte i bunden af den primære blomsterstandstamme (ca. 1 - 2 cm over rosetten) af 1 måned gamle Arabidopsis-planter . Vævet på overfladen af den primære stamme kan også ridses af sprøjten.
- 2-4 uger efter injektionen punktafgifter de nye hårede rødder og dyrker dem på petriskåle med det hårede rodvækstmedium suppleret med det selektive antibiotikum (båret af T-DNA) og cefotaxim (200 mg / L) og ticarcillin (500 mg / L) for at undertrykke agrobakteriel vækst. Pladerne inkuberes ved 24 °C i mørke.
- Efter 1 - 2 uger individualiseres de hårede rødder på plader med samme kulturmedium. Overfør de valgte hårede rodlinjer til et frisk medium hver 4. - 5. uge.
BEMÆRK: A. thaliana hårede rødder er tyndere end B. napus, og der skal udvises forsigtighed ved overførsel til friske medier. - Overfør de hårede rødder til plader med regenereringsmedium for at fremkalde callusdannelse. Dyrk pladerne ved 21 °C i en langdags fotoperiode (16 timers lys / 8 timer mørk).
- Skud kommer ud af callus efter 18 - 21 dages dyrkning. Skær skuddene og overfør dem til et skudforlængelsesmedium i 2 - 3 uger for at fremme vækst og forlængelse.
- Overfør de aflange skud til rodinduktionsmediet.
- Overfør de rodfæstede planter til jorden. T0 planter præsenterer også en Ri-fænotype. Udfør den transgene selektion, som beskrevet for B. napus DH12075 (trin 5).
Representative Results
Vi har tidligere optimeret en protokol til injektionsbaseret hårrodsinduktion i tre sorter af Brassica napus, nemlig DH12075, Topas DH4079 og Westar9. For at anvende denne transformationsprotokol på modelarten A. thaliana blev de primære blomsterstængler af 1 måned gamle planter injiceret med et agrobakterielt inokulum. Behårede rødder opstod på injektionsstedet efter 2-4 uger. Behårede rødder blev udskåret og dyrket på det faste medium. Sammenligningen af metoden i disse to arter er afbildet i figur 1.
Udvalgte hårede rodlinjer blev overført til regenereringsmediet for at fremkalde skuddannelse. I A. thaliana blev gul calli induceret inden for 14 dage i alle 10 testede hårede rodlinjer. Første skud primordia synlig som mørkegrønne pletter opstod inden for 3 uger efter overførsel til regenereringsmediet (figur 2). Efter 4 ugers kultur dækkede skuddene de hårede rødder i 9 ud af 10 hårede rodlinjer (90% regenereringseffektivitet). I nogle tilfælde blev utilsigtede rødder fremkaldt fra callus (figur 2H). En linje regenererede ikke selv efter 3 måneder på regenereringsmediet (hver 4. uge blev de hårede rødder overført til et frisk medium). Således ligner regenereringseffektiviteten af A. thaliana hårede rødder effektiviteten af B. napus DH120759.
Behårede rodregeneranter af B. napus og A. thaliana viser en dværgfænotype (figur 3), et typisk træk ved de behårede rodafledte planter2. Vi observerede også tætte rodsystemer, rynkede blade og ændringer i blomstringstiden. Denne såkaldte hårede rod (eller Ri) fænotype er forårsaget af rol-generne fra Ri-plasmidet indsat i plantegenomet. Indsættelsen af Ri T-DNA og transgenet kodet på en binær vektor kan være uafhængig eller forbundet. Således hjælper en adskillelsesanalyse af T1-afkom skabt ved selvbestøvning med at identificere rolfrie planter, der udtrykker transgenet af interesse. Genotypning af T1-planterne udføres af PCR-primere, der er specifikke for ORF'erne for TL og TR og transgenet af interesse. Fraværet af agrobakteriel kontaminering verificeres ved fraværet af PCR-produkter af virC-primere (figur 1).
Figur 1: Resumé af proceduren i A. thaliana og B. napus. Injektionen af Agrobacterium inoculum i hypocotyl eller primær blomsterstand inducerer udviklingen af hårede rødder. De hårede rødder kan erstatte de oprindelige rødder for at generere en sammensat plante, der vil blive genotypet og analyseret (blå pile). Kulturerede hårede rødder kan regenereres til T0-planter, formeres i T1-planter og genotypes (grønne pile). De behårede rødder kan også sub-dyrkes til funktionel analyse (sort pil). Eksempler på genotyperesultater præsenteres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Regenerering af behårede rødder i A. thaliana. (A) Behåret rodkultur 1 dag efter dens overførsel til plader. (B, C) Calli udviklede sig inden for 2 ugers kultur på regenereringsmedium. (D, E) Shoot primordia opstod efter 3 ugers kultur. (G, H) Skud dannes efter 4 uger. (H) Utilsigtede rødder udviklet fra callus. (C, F, I) Ikke-regenererende behåret rodlinje. Vægtstænger repræsenterer 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative fotos af B. napus og A. thaliana vildtypeplanter og hårrodsafledte regeneranter (T0-planter). Bemærk Ri-fænotypen af regeneranterne. Vægtstænger repræsenterer 2 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Vi udviklede en simpel protokol til hårrodstransformation og efterfølgende regenerering i B. napus og A. thaliana. Denne proces omfatter injektionsbaseret håret rodinduktion i hypocotyl (B. napus) eller primær blomsterstandstamme (A. thaliana). Metoden til injektion af hypocotyl med agrobakteriel stamme C58C1, der bærer et Ri-plasmid, var også effektiv i Fabaceae-familien10,11 ud over medlemmerne af Brassicaceae, der blev præsenteret i denne undersøgelse.
Et alternativ til den injektionsbaserede metode er den nedsænkningsbaserede transformation bestående af explant nedsænkning i en bakteriel suspension efterfulgt af co-dyrkning af explant med agrobakterier. Fordelen ved den injektionsbaserede metode i forhold til nedsænkningsmetoden er den tid, der spares ved fraværet af nogle protokoltrin: explantageforberedelse, en test af samdyrkningstiden og dyrkning på et medium indeholdende hormon til induktion af hårede rødder. Selvom begge tilgange er effektive til hårrodsinduktion, blev der observeret højere transformationseffektivitet hos nogle arter med den injektionsbaserede metode sammenlignet med explant-nedsænkningen en12,13. Desuden er injektionsbaseret transformation også nyttig til generering af sammensatte planter (transgene hårede rødder og vildtypeskud). Efter at have afskåret de oprindelige rødder af den transformerede plante, understøtter hårede rødder plantevæksten, og transgenet kan studeres i sammenhæng med hele planten.
Det kritiske trin i håret rodinduktion injicerer inokulum i hypocotyl eller primær blomsterstandstamme. Hypocotyls af B. napus er brudbare, og skære hele hypocotyl kan let ske. Det samme kan observeres med A. thaliana på grund af blomsterstandens stamme tyndhed. Hvis der kræves en sammenligning af forskellige arters/sorters transformationseffektivitet, anbefaler vi, at én person udfører alle forsøg for at undgå fejl forårsaget af manipulation og dygtighed til injektion af planterne.
Vi udviklede en effektiv protokol til hårrodsregenerering i B. napus DH12075 og A. thaliana Col-0. Da regenerering er en meget variabel proces, kan nogle protokolændringer anvendes på en art eller sort efter eget valg. For eksempel kan de hårede rodafledte skud fremkaldes af et andet auxin / cytokininforhold (1: 1) i B. oleracea14. Alternativt kan cytokinin thidiazuron anvendes i stedet for BAP, såsom i tilfælde af B. campestris hårede rødder15.
Flere indsættelser af Ri-plasmidet T-DNA i plantegenomet repræsenterer en potentiel begrænsning af det hårede rodtransformations- og regenereringssystem. I sådanne tilfælde afdækkes ingen planter, der er fri for TL / TR fra Ri-plasmidet efter en adskillelsesanalyse af T1-frøplanter. Derfor anbefaler vi at generere flere uafhængige hårede rodlinjer for hvert transgen.
Behårede rodkulturer er et ekstremt kraftfuldt værktøj til genfunktionelle undersøgelser, hovedsageligt på grund af deres hurtige etablering og billige vedligeholdelse (ingen hormoner er nødvendige i dyrkningsmedier). Denne protokol dækker metoderne til induktion og regenerering af hårrødder i B. napus og A. thaliana, som kan bruges til at studere transgenet af interesse direkte i hårede rodkulturer, i forbindelse med hele planten ved hjælp af sammensatte planter eller efter regenerering af de transgene planter.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført uden kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi anerkender Jiří Macas (Biology Centre CAS, České Budějovice, Tjekkiet) for at levere den agrobakterielle stamme. Core Facility Plants Sciences of CEITEC MU er anerkendt for sin tekniske support. Dette arbejde blev støttet af Tjekkiets ministerium for uddannelse, ungdom og sport med Den Europæiske Fond for Regionaludviklings projekt "SINGING PLANT" (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) og INTER-COST-projektet LTC20004.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.50 mL tubes | Eppendorf | 125.215 | |
| 10% solution of commercial bleach | SAVO | ||
| 1-naphthaleneacetic acid (NAA) | Duchefa | N0903 | Callus regeneration medium |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 108.132/108.078 | |
| 3M micropore tape | Micropore | ||
| 6-Benzylaminopurine (BAP) | Duchefa | B0904 | Callus regeneration medium, Shoot elongation medium |
| 70% ethanol | |||
| bacteriological agar | HiMedia | RM201 | LB medium |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | LB and YEB media |
| Beef extract | Roth | X975.1 | YEB medium |
| Bottles | DURAN | L300025 | |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
| chloroform | Serva | 3955301 | |
| CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide | Sigma | 52365 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | R0193 | |
| EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma | ES134-250G | |
| elctroporation cuvette | |||
| electrophesis agar, peqGOLD universal | VWR | 732-2789 | |
| electrophoresis chamber | BIO-RAD | ||
| electrophoresis gel reader | BIO-RAD | ||
| electroporator GenePulser Xcell | BIO-RAD | ||
| ethidium bromide | AppliChem | ||
| Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap | BIO-RAD | 1652082 | |
| Gene Ruler DNA ladder mix | Thermo Fisher Scientific | SM0331 | |
| Gibberellic acid (GA3) | Duchefa | G0907 | Shoot elongation medium |
| glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique | Merck | 1101100250 | |
| indole-3-butyric acid (IBA) | Duchefa | I0902 | Root induction medium |
| kanamycin monosulfate | Duchefa | K0126 | |
| Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid | Plant Media | V8505-100 | |
| Measuring cylinder | |||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
| Murashige and Skoog medium (MS) | Duchefa | M0237 | Medium for germination, Plant growing medium |
| Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins | Duchefa | M0231 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
| needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm | Terumo | ||
| pH meter | |||
| Phytagel | Sigma | P8169 | Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination |
| PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000) | Sigma | 9003-39-8 | |
| Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included | Sigma | D4309-250UN | |
| Retsh mill | Qiagen | ||
| sodium chloride | Lachner | 30093-APO | LB medium |
| square Petri Dishes | Corning | GOSSBP124-05 | |
| sucrose | Penta | 24970-31000 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
| Syringe filter | Carl Roth | P666.1 | Rotylabo syringe filters 0.22 µm pore size |
| thermomixer | Eppendorf | ||
| Ticarcillin disodium | Duchefa | T0180 | Hairy root growing medium |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethan | Serva | 3719003 | |
| ultrapure water | Millipore Milli-Q purified water | ||
| Yeast extract | Duchefa | Y1333 | LB medium |
References
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Christey, M. C. Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures—a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean. Plants. 11 (8), 1044 (2022).
- Petit, A., et al. Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation. Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).
- Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops. Crop improvement. , Springer. Boston, MA. (2013).
- Jedličková, V., et al. Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus). Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).
- Steinbauerová, V., Neumann, P., Macas, J. Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).
- Neumann, P., et al. Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species. Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).
- Montazeri, M., et al. A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum. Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).
- Zhang, X., et al. Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response. Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).
- Christey, M. C., Sinclair, B. K. Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation. Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).
- Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation. Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).
