Summary
Het protocol beschrijft de inductie van harige wortels met behulp van Arabidopsis primaire bloeiwijzestengels en Brassica napus hypocotyls. De harige wortels kunnen worden gekweekt en gebruikt als explantaten om transgene planten te regenereren.
Abstract
Harige worteltransformatie is een veelzijdig hulpmiddel voor plantenbiotechnologie in verschillende soorten. Infectie door een Agrobacterium-stam die een wortelinducerend (Ri) plasmide draagt, induceert de vorming van harige wortels op de wondplaats na de overdracht van T-DNA van het Ri-plasmide naar het plantengenoom. Het protocol beschrijft in detail de procedure van de op injectie gebaseerde inductie van haarwortels in Brassica napus DH12075 en Arabidopsis thaliana Col-0. De harige wortels kunnen worden gebruikt om een interessant transgen te analyseren of worden verwerkt voor het genereren van transgene planten. Regeneratiemedium dat cytokinine-6-benzylaminopurine (5 mg/l) en auxine-1-naftaleenazijnzuur (8 mg/l) bevat, lokt bij beide soorten met succes scheutvorming uit. Het protocol omvat de genotypering en selectie van regeneratieve stoffen en T1-planten om planten te verkrijgen die een interessant transgen dragen en vrij zijn van T-DNA uit het Ri-plasmide. Er wordt ook een alternatief proces afgebeeld dat leidt tot de vorming van een composietplant. In dit geval worden harige wortels op de scheut gehouden (in plaats van de natuurlijke wortels), wat de studie van een transgen in harige wortelculturen in de context van de hele plant mogelijk maakt.
Introduction
Planttransformatie is het knelpunt van elke genetische studie in de plantenbiologie. Een bodembacterie, Agrobacterium tumefaciens, wordt veel gebruikt als middel voor genafgifte door middel van bloemendip of weefselkweek om transformanten te genereren. A. tumefaciens infecteert planten op een verwondingsplaats en veroorzaakt tumoren als gevolg van de overdracht en integratie van T-DNA van een tumor-inducerend (Ti) plasmide in het genoom van de waardplant. Gemanipuleerde A. tumefaciens-stammen met gemodificeerd Ti-plasmide zonder het wildtype T-DNA en een binaire vector met kunstmatig T-DNA en kloonplaatsen voor het inbrengen van een interessant gen worden vaak gebruikt als een efficiënt planttransformatiesysteem1. Veel modelsoorten en -gewassen zijn echter recalcitrant voor bloemendip of in vitro plantenregeneratie of hebben lange groeicycli, wat van invloed is op de efficiëntie van dit transformatiesysteem.
Agrobacterium rhizogenes induceert de vorming van onvoorziene wortels, of harige wortels, op de wondplaats na infectie van een waardplant. Net als A. tumefaciens brengt A. rhizogenes een T-DNA over van een wortelinducerend (Ri) plasmide naar het genoom van de waardplant, waardoor transgene harige wortels ontstaan. Dit proces wordt voornamelijk gecontroleerd door de wortel-oncogene loci (rol)-genen 2,3. Met behulp van agrobacteriële stammen die zowel het Ri-plasmide als een kunstmatige binaire vector dragen die codeert voor een gen van belang, zijn harige wortelculturen gebruikt om recombinante eiwitten te produceren, de functie van promotors of genen te analyseren of genomen te bewerken met behulp van geclusterde regelmatig tussenliggende korte palindroomherhalingen (CRISPR's)/CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (Cas9)4,5,6.
Ons protocol maakt gebruik van de transconjugante stam Ti-less A. tumefaciens C58C1 die drager is van het Ri-plasmide pRiA4b7. Het T-DNA van het Ri-plasmide bestaat uit twee regio's, rechter en linker T-DNA (RESPECTIEVELIJK TR-DNA en TL-DNA), die onafhankelijk van elkaar kunnen integreren in het plantengenoom8. Door gebruik te maken van dit systeem werd het langdurige explantatietransformatieproces in Brassica napus DH12075 cultivar geoptimaliseerd9. Het hieronder beschreven protocol maakt het mogelijk om geselecteerde harige wortellijnen te regenereren en T1-planten te verkrijgen die het transgen van belang dragen en vrij zijn van rolgenen in ongeveer 1 jaar. De op injectie gebaseerde harige worteltransformatie kan worden gebruikt in andere Brassicaceae-soorten, zoals blijkt uit transformatie van Arabidopsis thaliana Col-0. Terwijl hypocotyl wordt gebruikt om B. napus te transformeren, wordt A. thaliana geïnjecteerd in de primaire bloeiwijzestengel.
Protocol
1. Voorbereiding van media en oplossingen
- Bereid de hormoonvoorraadoplossingen voor.
- Voor de bereiding van 50 ml 1-naftaleenazijnzuur (NAA), 6-benzylaminopurine (BAP) en indol-3-boterzuur (IBA) stockoplossing met een concentratie van 5 mg/ml, lost u 250 mg van het hormoon in poedervorm op in 2 ml 1 M natriumhydroxide (NaOH) en past u het volume aan tot 50 ml met ultrapuur water.
- Om 50 ml gibberellinezuur (GA3) met een concentratie van 1 mg/ml te bereiden, lost u 50 mg van het poedervormige hormoon op in 2 ml ethanol en past u het volume aan op 50 ml ultrapuur water.
- Filtreer de oplossing met behulp van een steriel spuitfilter met een poriegrootte van 0,22 μm en verdeel het in steriele buisjes van 2 ml voor opslag. Bewaar de oplossing bij -20 °C of 4 °C, afhankelijk van de aanbeveling van de fabrikant.
- Bereid antibiotische voorraadoplossingen voor. Los voor 50 ml cefotaxime en ticarcillin-dinatriumoplossing met een concentratie van 100 mg/ml 0,5 g van het antibioticum in poedervorm op in 40 ml ultrapuur water en pas aan tot een eindvolume van 50 ml. Filtreer de oplossing met behulp van een steriel spuitfilter met een poriegrootte van 0,22 μm en verdeel het in steriele buisjes van 2 ml voor opslag. Bewaar de oplossing bij -20 °C.
OPMERKING: Antibiotica en hormonen worden altijd toegevoegd aan het gekoelde medium. - Bereid 1 L Luria Bouillon (LB) medium door 10 g bacto-trypton, 5 g gistextract en 5 g natriumchloride (NaCl) toe te voegen in een maatcilinder van 1 L en pas het volume aan op 1 L met dubbel gedestilleerd water. Stel de pH in op 7,0 met KOH met een pH-meter (volgens de instructies van de fabrikant). Breng de oplossing over in een fles van 1 L en voeg 15 g bacteriologische agar (1,5%) toe, als er een vast medium is bereid, en autoclaaf het medium. Voeg indien nodig de juiste antibiotica (bacteriële resistentie wordt gedragen op de binaire vector) toe aan het afgekoelde medium.
NOTITIE: Gebruik een autoclaaf om de oplossing te steriliseren. Plaats de fles in de mand, sluit het deksel en steriliseer hem gedurende 20 minuten op 121 °C en 98,9 kPa. Dit protocol wordt altijd gebruikt voor autoclaveroplossingen in verdere stappen. - Bereid 1 l Yeast Extract Beef (YEB) medium door 5 g rundvleesextract, 1 g gistextract, 5 g pepton, 5 g sucrose en 0,5 g magnesiumchloride (MgCl2) te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L. Breng de oplossing over in een fles van 1 L. Autoclaaf het medium.
- Bereid 1 L medium voor het ontkiemen van het zaad door 2,2 g Murashige en Skoog (MS) poeder, 10 g sucrose (1%) en 0,5 g 2-(N-Morpholino)ethaansulfonzuur (MES) natriumzouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH. Breng de oplossing over in een fles van 1 liter en voeg 8 g plantaardige agar (0,8%) toe. Autoclaaf het medium.
- Bereid 1 L plantengroeimedium door 2,2 g MS-poeder, 5 g sucrose (0,5%) en 0,5 g MES-zouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH. Breng de oplossing over in een fles van 1 liter en voeg 8 g plantaardige agar (0,8 %) toe. Autoclaaf het medium.
- Bereid 1 L harig wortelgroeimedium door 4,4 g MS + B5-vitaminepoeder, 30 g sucrose (3%) en 0,5 g MES-zouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH, en breng de oplossing over in een fles van 1 L. Voeg 3 g geleermiddel (0,3%) toe en autoclaaf het medium. Voeg cefotaxime en ticarcillindinatrium toe tot een eindconcentratie van respectievelijk 100 - 200 mg/l en 100 - 500 mg/l. Voeg indien nodig de juiste antibiotica toe (resistentie is te wijten aan het T-DNA van een binaire vector).
- Bereid 1 L samengesteld plantengroeimedium door 2,2 g MS + B5-vitaminepoeder, 10 g sucrose (1%) en 0,5 g MES-zouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH en breng de oplossing over in een fles van 1 L. Voeg 6 g geleermiddel (0,6%) toe en autoclaaf het medium. Voeg cefotaxime en ticarcillindinatrium toe tot een eindconcentratie van respectievelijk 200 mg/l en 500 mg/l. Voeg indien nodig de juiste antibiotica toe (resistentie is te wijten aan het T-DNA van een binaire vector).
- Bereid 1 L regeneratiemedium door 4,4 g MS + B5-vitaminepoeder, 30 g sucrose (3%) en 0,5 g MES-zouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH. Breng de oplossing over in een fles van 1 l en voeg 3 g geleermiddel (0,3 %) toe. Autoclaaf het medium. Voeg NAA en BAP toe tot een eindconcentratie van respectievelijk 8 mg/l en 5 mg/l, en ticarcillindinatrium tot een eindconcentratie van 100 mg/l.
- Bereid 1 L scheutverlengingsmedium door 4,4 g MS + B5-vitaminepoeder, 20 g sucrose (2%) en 0,5 g MES-zouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH. Breng de oplossing over in een fles van 1 liter en voeg 3 g plantenagar (0,3%) toe. Autoclaaf het medium. Voeg BAP en GA3 toe tot een eindconcentratie van respectievelijk 0,5 mg/l en 0,03 mg/l en cefotaxime tot een eindconcentratie van 100 mg/l.
- Bereid 1 L wortelinductiemedium door 2,2 g MS + B5-vitaminepoeder, 10 g sucrose (1%) en 0,5 g MES-zouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH. Breng de oplossing over in een fles van 1 L en voeg 3 g geleermiddel (0,3%) toe. Autoclaaf het medium. Voeg IBA en cefotaxime toe tot een eindconcentratie van respectievelijk 0,5 mg/l en 100 mg/l.
- Bereid 1 l cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB)-buffer door toevoeging van 20 g CTAB (2% m/v definitief), 100 ml 1M Tris-HCl, pH 8,0 (100 mM definitief), 40 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 (20 mM definitief), 81,8 g NaCl (1,4 M definitief) en 5 g PVP40 (0,5% m/v definitief). Stel in op 1 L met dubbel gedestilleerd water. Autoclaaf de oplossing. Bewaar de oplossing maximaal 1 jaar bij kamertemperatuur.
2. Transformatie van Agrobacterium met een binaire vector
- Bereid het DNA van een geverifieerd binair plasmide met de T-DNA-cassette voor om in het plantengenoom te worden geïntegreerd. Zorg ervoor dat het plasmide-DNA weinig zouten bevat om elektrische vonken te voorkomen, aangezien elektroporatie wordt gebruikt. Het gebruik van een plasmide-DNA-extractiekit naar keuze wordt aanbevolen.
- Bereid elektrocompetente Agrobacterium tumefaciens C58C1-cellen die het harige wortelinducerende plasmide pRiA4b bevatten door 200 ml voorverwarmde (28 °C) YEB te inoculeren met 8 ml verse nachtkweek. Incubeer de cultuur bij 28 °C tijdens het schudden tot de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) ongeveer 0,5 bedraagt, wat overeenkomt met de mid-log-fase. Het duurt ongeveer 4 - 5 uur.
- Verdeel de Agrobacterium-cultuur over vier voorgekoelde steriele centrifugebuisjes van 50 ml. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 3.200 x g.
NOTITIE: De cellen moeten vanaf deze stap koud worden gehouden. - Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet voorzichtig in (4x) 2,5 ml koude (4 °C) 10% glycerol. Voeg nog eens 47,5 ml koude 10% glycerol toe en meng voorzichtig.
- Pelletcellen bij 3.200 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in (4x) 10 ml koude 10% glycerol.
- Pelleteer de cellen opnieuw en resuspendeer ze in (4x) 0,75 ml koude 10% glycerol. Bundel de inhoud van alle vier de buisjes in één (totaal volume = 3 ml).
- Verdeel de agrobacteriële oplossing in aliquots van 50 μl in voorgekoelde steriele microbuisjes van 1,5 ml. Vries de aliquots in op droogijs of vloeibare stikstof. Bewaar de buizen bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
- Plaats een buisje competente cellen (50 μL) op ijs, meng met 5 μL plasmide-DNA (1 μg in totaal, uit stap 2.1), breng het mengsel over in een elektroporatiecuvet (0,2 cm opening) en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
- Plaats de cuvet in de elektroporator en elektropoleer de cellen met de volgende instellingen: capaciteit 25 μFD, weerstand 400 Ω, elektrische spanning 2,5 kV, pulsduur 9,7 ms.
- Voeg 950 μL LB vloeibaar medium toe aan de cellen, die vervolgens gedurende 2 uur bij 300 tpm bij 28 °C in een thermomixer worden gekweekt. Plaats 50 μL van de celkweek op een vast LB-medium met het juiste selectieve antibioticum. Kweek de platen gedurende 2 dagen bij 28 °C.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een reeks celculturen (10 μL - 100 μL) per plaat te plaatsen om een goed kweekvolume te bepalen en overgroei van bacteriën te voorkomen. - Bereid vloeibare culturen van een paar geselecteerde kolonies in 5 ml LB vloeibaar medium met antibiotica. Laat de bacteriën een nacht groeien bij 28 °C door te schudden. Gebruik deze culturen voor glycerolvoorraden door 0,5 ml vloeibare bacteriecultuur en 0,5 ml 40% glycerol te mengen.
OPMERKING: Deze kolonies worden geverifieerd op de aanwezigheid van het transgen door middel van kolonie-PCR. Voeg hiervoor een kleine hoeveelheid van een kolonie van een plaat toe aan de PCR-mastermix met buffer, dNTP en Taq-polymerase naar keuze, samen met primers die een deel van het T-DNA van een binaire vector amplificeren. Inoculum uit de glycerolvoorraden wordt gebruikt voor de transformatie van de planten.
3. Harige worteltransformatie van Brassica napus DH12075
- Plaats zaden van Brassica napus DH12075 in microbuisjes en steriliseer ze in een stroomdoos. Ontvet eerst de zaden met water en 0,1% afwasmiddel terwijl je 60 s schudt. Spoel de zaden vervolgens af met water, gevolgd door 70% ethanol, beide gedurende 60 seconden.
- Steriliseer de zaden met een 10% -oplossing van commercieel bleekmiddel dat natriumhypochloriet bevat. Schud de zaden in deze oplossing gedurende 20 min.
- Was de zaden 4x met steriel water gedurende 60 s per stuk. Leg ze op petrischaaltjes met daarin het kiemmedium van het zaad. Stratificeer de zaden 's nachts bij 4 °C en verplaats de platen naar een kweekruimte (21 °C, 16 uur licht / 8 uur donker).
- Breng zaailingen van 5 dagen oud over naar plantenkweekdozen met een plantengroeimedium.
OPMERKING: De beste transformatie-efficiëntie in DH12075 werd geïdentificeerd voor zaailingen van 18 dagen oud. De leeftijd van de zaailingen kan worden geoptimaliseerd voor de lokale groeiomstandigheden of andere cultivars. - Inoculeer een vloeibare cultuur van Agrobacterium tumefaciens C58C1 met een harige wortelinducerende plasmide pRiA4b en de binaire vector voor transformatie (uit stap 2.11) met een inoculatielus. Gebruik 5 ml LB-medium. Kweek deze cultuur 's nachts bij 28 °C tot OD600 = 0,9 - 1.
OPMERKING: Agrobacterium dat alleen het Ri-plasmide bevat, wordt gebruikt als wildtype harige wortels worden geproduceerd. - Injecteer een kleine hoeveelheid kweek (ongeveer 50 μL) met een insulinespuit in het hypocotyl van een zaailing van 18 dagen oud (vanaf stap 3.4.). Prik het hypocotyl door met een naald van 26 G die op de spuit is gemonteerd op ongeveer 1 cm boven het oppervlak van het medium. Injecteer de vloeistof in de wond. Het weefsel op het oppervlak van het hypocotyl kan ook door de spuit worden bekrast.
OPMERKING: Het aantal geïnoculeerde zaailingen moet worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker. - Zet de planten 2 tot 4 weken terug in de kweekruimte bij 21 °C totdat er eelt en harige wortels zijn gevormd op de plaats waar de verwonding plaatsvindt.
- Snijd het eelt met de ontstane harige wortels van het hypocotyl af en plaats het op een petrischaal met het harige wortelgroeimedium met selectieve antibiotica (gedragen door het T-DNA) en cefotaxime (200 mg/L) en ticarcilline (500 mg/L) om de groei van agrobacteriën te onderdrukken. Sluit de petrischaaltjes af met gasdoorlatende tape. Kweek de harige wortels bij 24 °C in het donker.
OPMERKING: De juiste concentratie van specifieke antibiotica die worden gebruikt voor functionele selectie moet worden getest met wildtype harige wortels. Voor B. napus DH12075 harige wortels die resistent zijn tegen kanamycine, wordt een concentratie van 25 mg/L kanamycine gebruikt.
OPMERKING: In deze stap is het mogelijk om een samengestelde plant te genereren die bestaat uit de wildtype scheut en transgene harige wortels die de groei van een dergelijke plant ondersteunen. In plaats van de harige wortels van een stengel af te snijden, worden de inheemse wortels van de plant verwijderd. De plant met opkomende harige wortels wordt overgebracht naar een plantenkweekdoos met een samengesteld plantengroeimedium dat cefotaxime (200 mg/L) en ticarcilline (500 mg/L) bevat om de groei van agrobacteriën te onderdrukken, en het selectieve antibioticum (gedragen door het T-DNA). - Isoleer na 1 - 2 weken de harige wortels op de petrischaal van het eelt en individualiseer ze op borden met hetzelfde kweekmedium. Breng de cultuur elke 4 tot 5 weken over op een vers bord. Voeg 0,25 mg/L IBA toe om de wortelvertakking te vergroten.
- Verlaag de concentraties cefotaxime en ticarcillin geleidelijk bij elke overdracht met 100 mg/l (d.w.z. het medium voor de eerste overdracht bevat 100 mg/l cefotaxime en 400 mg/l ticarcilline; voor de tweede overdracht, 300 mg/l ticarcilline, enz.). Kweek na 3 - 4 maanden de harige wortels op een harig wortelgroeimedium met 100 mg/L ticarcilline en het selectieve antibioticum.
4. Regeneratie van Brassica napus DH12075 harige wortels
- Breng onafhankelijke harige wortellijnen over naar platen met regeneratiemedium in steriele omstandigheden met behulp van een pincet, gevlamd voor gebruik. Breng 5 - 10 wortels per petrischaaltje over en kweek ze op bij 21 °C in een lange fotoperiode (16 uur licht / 8 uur donker). Sluit de petrischaaltjes af met gasdoorlatende tape.
- Breng de harige wortels elke 3 tot 4 weken over naar platen met vers regeneratiemedium. Merk op dat calli na ongeveer 2 weken worden gevormd. Het eelt begint na nog eens 2 weken te schieten tot 8 - 9 weken na eeltvorming.
- Individualiseer de scheuten en breng ze gedurende 2 tot 3 weken over in plantenkweekdozen met scheutverlengingsmedium om de verlenging van de scheuten te bevorderen.
- Breng de langwerpige scheuten over naar plantenkweekdozen met een wortelinductiemedium. Ververs de cultuur elke 3 - 4 weken. De bewortelingsefficiëntie in DH12075 is 87% na 30 dagen en tot 100% na 60 dagen.
- Breng de gewortelde planten over naar de grond na het verwijderen van eventuele sporen van geleermiddel om schimmelinfectie te voorkomen. Zorg ervoor dat de planten eerst worden geacclimatiseerd in de fytotrons (21 °C, lange dag fotoperiode, 150 μE) en breng ze vervolgens over naar een kas voor bloei (21 °C / 18 °C, lange dag fotoperiode, 150 μE).
5. Selectie van regeneratie- en T1-planten
OPMERKING: De harige wortellijnen kunnen worden geselecteerd voordat u het regeneratieproces ingaat. Het type selectie hangt af van de inhoud die door het transgen wordt gedragen. De harige wortels kunnen worden bemonsterd voor DNA-extractie en genotypering of mutatiedetectie, RNA-extractie met daaropvolgende cDNA-synthese en RT-qPCR voor expressieniveau-analyse van het gen naar keuze, microscopie voor fluorescentiedetectie of behandeld voor GUS-kleuring.
- Na overdracht in de bodem moet de T0-regeneratieve planten (en T1-zaailingen) opnieuw worden gegenotypeerd om te voorkomen dat ze ontsnappen aan de selectieprocedures. T0-planten vertonen een veranderd fenotype dat Ri-fenotype wordt genoemd: uitgebreide wortelgroei, gekrulde bladeren en dwergscheuten veroorzaakt door de aanwezigheid van het TL en/of TR-DNA van het Ri-plasmide dat in het plantengenoom is ingebracht.
- Om de T1-selectie te versnellen, gebruikt u de zaden met groene rijpe embryo's (ca. 21 - 28 dagen na bestuiving voor DH12075 voor een torpedo-embryo of ouder) van T0-regeneratieve planten voor het redden van embryo's.
- Werk in de steriele flowbox. Verzamel de siliques en steriliseer ze aan de oppervlakte met 70% ethanol.
- Plaats ze op een dubbelzijdige tape die op een plaatdeksel of een dia is geplakt.
- Snijd met een stereo-verrekijker de silique langs de klepranden door met een 26G-naald. Zorg ervoor dat de snede de zaden niet beschadigt. Voor een gemakkelijke grip monteert u de naald op een spuit van 1 ml.
- Open de vruchtbladen en plak ze op de tape. Verzamel de onrijpe zaden en breng ze over naar borden met medium voor het ontkiemen van zaden. Sluit de platen af met gasdoorlatende tape.
- Plaats de platen in een kweekruimte (21 °C, 16 uur licht / 8 uur donker) tot ze ontkiemen.
- Genotypeer de T1-zaailingen op de aanwezigheid van het betreffende transgen en de afwezigheid van de Ri TR/TL (figuur 1). Verzamel bladmateriaal en extraheer hun DNA met behulp van de methode naar keuze. De CTAB methode wordt hier beschreven:
- Vang het bladmateriaal op in een microbuisje van 2 ml met daarin twee keramische kralen. Vries de buis in vloeibare stikstof in.
- Maal het materiaal met behulp van een kogelmolen. Als alternatief kan stamper en vijzel worden gebruikt.
- Voeg na een snelle centrifuge 400 μL CTAB-buffer toe aan het poeder. Draai kort, draai naar beneden en incubeer bij 60 °C gedurende ten minste 50 minuten.
- Koel de oplossing gedurende 15 minuten af tot kamertemperatuur. Voeg een deel chloroform toe en meng voorzichtig.
LET OP: Werk bij het gebruik van chloroform onder de chemische stroom en gebruik handschoenen ter bescherming. Elke oplossing die chloroform bevat, moet in de daarvoor bestemde afvalbak worden weggegooid. - Centrifugeer gedurende 5 minuten op 18.400 x g met behulp van een tafelcentrifuge. Breng 250 - 350 μL van de bovenste waterige fase over naar een nieuwe microbuis. Laat de interfase weg.
- Voeg een deel isopropanol toe, meng goed en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 40 minuten op 18.400 x g.
- Gooi de vloeistof weg en voeg 200 μL 70% ethanol toe. Was de pellet en centrifugeer gedurende 15 minuten op 18.400 x g.
- Gooi de vloeistof weg. Laat de pellet aan de lucht drogen en voeg 50 - 100 μL ultrapuur water toe. Laat het DNA 1 uur tot een nacht oplossen in de koelkast.
- Voer een genotypering uit door middel van PCR voor het rolA-gen (TL), het aux1-gen (TR) en de virC-locus (Agrobacterium). Bereid de PCR-reactie voor met behulp van het geprepareerde DNA (uit stap 5.3.), primers, buffer, dNTP en Taq-polymerase volgens het protocol van de fabrikant. De versterkte fragmenten zijn 200 - 500 bp lang.
Primers specifiek voor rolA:
Vooruit: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAG
Keerzijde: TGCGTATTAATCCCGTAGGTC
Primers specifiek voor aux1:
Vooruit: CATAGGATCGCCTCACAGGT
Keerzijde: CGTTGCTTGATGTCAGGAGA
Primers specifiek voor virC:
Vooruit: AATGCGTCTCTCTCGTGCAT
Keerzijde: AAACCGACCACTAACGCGAT
OPMERKING: T-DNA-overdracht en -integratie kunnen gedeeltelijk zijn en slechts delen van TL en/of TR kunnen in het genoom worden geïntegreerd. Het wordt dus aanbevolen om de aanwezigheid van andere ORF's van TL (bijv. rolB en rolC) en TR (aux2, mas1, ags1) in T1-zaailingen te analyseren. Primersequenties die specifiek zijn voor deze loci zijn vermeld in Jedličková et al.9. - Evalueer PCR-reacties door gelelektroforese.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een positieve controle in deze analyse op te nemen om er zeker van te zijn dat u DNA van PCR-kwaliteit heeft. - Selecteer op de aan- (of afwezigheid) van het transgen volgens de protocollen op basis van de inhoud van dit transgen.
- Breng geselecteerde zaailingen over naar de grond.
6. Transformatie en regeneratie van harige wortels bij Arabidopsis thaliana Col-0
- Steriliseer A. thaliana zaden met een methode naar keuze (bleekmiddel, ethanol of chloorgas).
- Leg steriele zaden op een medium voor het ontkiemen van zaden. Verplaats de platen na 2 dagen koude stratificatie naar een kweekruimte (21 °C met lange fotoperiode en 50% luchtvochtigheid).
- Breng zaailingen van 1 week oud over naar een plantenkweekdoos met plantengroeimedium.
- Bereid Agrobacterium-culturen voor zoals aangegeven in stap 3.5.
- Injecteer een kleine hoeveelheid kweek (ongeveer 50 μL) met een naald op een insulinespuit aan de basis van de primaire bloeiwijzestengel (ongeveer 1 - 2 cm boven de rozet) van 1 maand oude Arabidopsis-plantjes . Het weefsel op het oppervlak van de primaire stengel kan ook door de spuit worden bekrast.
- Snijd 2-4 weken na de injectie de opkomende harige wortels weg en kweek ze op petrischalen met het harige wortelgroeimedium aangevuld met het selectieve antibioticum (gedragen door het T-DNA) en cefotaxime (200 mg/L) en ticarcillin (500 mg/L) om de groei van agrobacteriën te onderdrukken. Incubeer de platen bij 24 °C in het donker.
- Individualiseer na 1 - 2 weken de harige wortels op platen met hetzelfde kweekmedium. Breng de geselecteerde harige wortellijnen elke 4 - 5 weken over naar een vers medium.
OPMERKING: De harige wortels van A. thaliana zijn dunner dan die van B. napus en voorzichtigheid is geboden bij het overbrengen naar verse media. - Breng de harige wortels over naar platen met regeneratiemedium om eeltvorming te induceren. Kweek de platen bij 21 °C in een lange fotoperiode (16 uur licht / 8 uur donker).
- Scheuten komen na 18 - 21 dagen cultivatie uit het eelt. Snijd de scheuten af en breng ze 2 - 3 weken over op een scheutverlengingsmedium om groei en rek te bevorderen.
- Breng de langwerpige scheuten over naar het wortelinductiemedium.
- Breng de gewortelde planten over naar de grond. T0-planten vertonen ook een Ri-fenotype. Voer de transgene selectie uit, zoals beschreven voor B. napus DH12075 (stap 5).
Representative Results
We hebben eerder een protocol geoptimaliseerd voor inductie van haarwortels op basis van injectie in drie cultivars van Brassica napus, namelijk DH12075, Topas DH4079 en Westar9. Om dit transformatieprotocol toe te passen op de modelsoort A. thaliana, werden de primaire bloeiwijzestengels van 1 maand oude plantjes geïnjecteerd met een agrobacterieel inoculum. Harige wortels verschenen na 2-4 weken op de injectieplaats. Harige wortels werden weggesneden en gekweekt op het vaste medium. De vergelijking van de methode bij deze twee soorten is weergegeven in figuur 1.
Geselecteerde harige wortellijnen werden overgebracht naar het regeneratiemedium om scheutvorming te induceren. Bij A. thaliana werden gele calli binnen 14 dagen geïnduceerd in alle 10 geteste harige wortellijnen. De eerste primordia die zichtbaar zijn als donkergroene vlekken die binnen 3 weken na overdracht naar het regeneratiemedium ontstonden (Figuur 2). Na 4 weken kweken bedekten de scheuten de harige wortels in 9 van de 10 harige wortellijnen (90% regeneratie-efficiëntie). In sommige gevallen werden onvoorziene wortels uit het eelt opgewekt (Figuur 2H). Eén lijn regenereerde niet, zelfs niet na 3 maanden op het regeneratiemedium (elke 4 weken werden de harige wortels overgebracht naar een nieuw medium). De regeneratie-efficiëntie van de harige wortels van A. thaliana lijkt dus op de efficiëntie van B. napus DH120759.
Harige wortelregeneratieven van B. napus en A. thaliana vertonen een dwergfenotype (Figuur 3), een typisch kenmerk van de harige wortelplanten2. We zagen ook dichte wortelstelsels, gerimpelde bladeren en veranderingen in de bloeitijd. Dit zogenaamde harige wortel (of Ri) fenotype wordt veroorzaakt door de rolgenen van het Ri-plasmide die in het plantengenoom zijn ingebracht. De insertie van het Ri T-DNA en het transgen gecodeerd op een binaire vector kan onafhankelijk of gekoppeld zijn. Een segregatieanalyse van T1-nakomelingen die door zelfbestuiving zijn ontstaan, helpt dus om rolvrije planten te identificeren die het transgen van belang tot expressie brengen. Genotypering van de T1-planten wordt uitgevoerd door PCR-primers die specifiek zijn voor de ORF's van TL en TR en het transgen van belang. De afwezigheid van agrobacteriële besmetting wordt geverifieerd door de afwezigheid van PCR-producten van virC-primers (Figuur 1).
Figuur 1: Samenvatting van de procedure bij A. thaliana en B. napus. De injectie van het Agrobacterium inoculum in de hypocotyl of primaire bloeiwijzestengel induceert de ontwikkeling van harige wortels. De harige wortels kunnen de inheemse wortels vervangen om een samengestelde plant te genereren die zal worden gegenotypeerd en geanalyseerd (blauwe pijlen). Gekweekte harige wortels kunnen worden geregenereerd tot T0-planten, vermeerderd in T1-planten en gegenotypeerd (groene pijlen). De harige wortels kunnen ook worden gesubcultiveerd voor functionele analyse (zwarte pijl). Voorbeelden van genotyperingsresultaten worden gepresenteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Regeneratie van harige wortels bij A. thaliana. (A) Harige wortelcultuur 1 dag na het overbrengen op platen. (B, C) Calli ontwikkelde zich binnen 2 weken na kweek op regeneratiemedium. (D, E) Shoot primordia kwam tevoorschijn na 3 weken kweken. (G, H) Scheuten worden na 4 weken gevormd. (H) Adventieve wortels ontwikkelden zich uit het eelt. (C, F, I) Niet-regenererende harige wortellijn. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve foto's van B. napus en A. thaliana wildtype planten en van harige wortels afgeleide regeneranten (T0-planten). Let op het Ri-fenotype van de regeneratieven. Schaalbalken vertegenwoordigen 2 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
We ontwikkelden een eenvoudig protocol voor haarworteltransformatie en daaropvolgende regeneratie in B. napus en A. thaliana. Dit proces omvat op injectie gebaseerde inductie van harige wortels in de hypocotyl (B. napus) of primaire bloeiwijzestengel (A. thaliana). De methode om het hypocotyl te injecteren met agrobacteriële stam C58C1 die een Ri-plasmide draagt, was ook effectief in de Fabaceae-familie10,11, naast de leden van Brassicaceae die in deze studie werden gepresenteerd.
Een alternatief voor de op injectie gebaseerde methode is de op onderdompeling gebaseerde transformatie bestaande uit explantatie-onderdompeling in een bacteriële suspensie, gevolgd door co-cultivatie van de explantatie met agrobacteriën. Het voordeel van de op injectie gebaseerde methode ten opzichte van de onderdompelingsmethode is de tijdwinst door het ontbreken van enkele protocolstappen: explantatievoorbereiding, een test van de co-cultivatietijd en kweek op een hormoonhoudend medium voor inductie van harige wortels. Hoewel beide benaderingen effectief zijn voor inductie van harige wortels, werd bij sommige soorten een hogere transformatie-efficiëntie waargenomen met de op injectie gebaseerde methode in vergelijking met de explantatie-onderdompeling12,13. Bovendien is transformatie op basis van injectie ook nuttig voor het genereren van samengestelde planten (transgene harige wortels en wildtype scheuten). Na het afsnijden van de oorspronkelijke wortels van de getransformeerde plant, ondersteunen harige wortels de plantengroei en kan het transgen worden bestudeerd in de context van de hele plant.
De cruciale stap van harige wortelinductie is het injecteren van het inoculum in de hypocotyl of primaire bloeiwijzestengel. De hypocotylen van B. napus zijn breekbaar en het doorsnijden van de hele hypocotyl kan gemakkelijk gebeuren. Hetzelfde kan worden waargenomen bij A. thaliana vanwege de bloeiwijze stengeldunheid. Als een vergelijking van de transformatie-efficiëntie van verschillende soorten/cultivars vereist is, raden we aan dat één persoon alle experimenten uitvoert om de fout te voorkomen die wordt veroorzaakt door manipulatie en vaardigheid bij het injecteren van de planten.
We ontwikkelden een effectief protocol voor haarwortelregeneratie in B. napus DH12075 en A. thaliana Col-0. Aangezien regeneratie een zeer variabel proces is, kunnen enkele protocolwijzigingen worden toegepast op een soort of cultivar naar keuze. De harige wortelscheuten kunnen bijvoorbeeld worden opgewekt door een andere auxine/cytokinine-verhouding (1:1) in B. oleracea14. Als alternatief kan cytokininethidiazuron worden gebruikt in plaats van BAP, zoals in het geval van B. campestris harige wortels15.
Meervoudige inserties van het Ri-plasmide T-DNA in het plantengenoom vertegenwoordigen een mogelijke beperking van het transformatie- en regeneratiesysteem van harige wortels. In dergelijke gevallen worden geen planten die vrij zijn van TL/TR uit het Ri-plasmide ontdekt na een segregatieanalyse van T1-zaailingen. Daarom raden we aan om voor elk transgen meerdere onafhankelijke harige wortellijnen te genereren.
Harige wortelculturen zijn een uiterst krachtig hulpmiddel voor genfunctionele studies, vooral vanwege hun snelle vestiging en goedkoop onderhoud (geen hormonen nodig in kweekmedia). Dit protocol behandelt de methoden voor inductie en regeneratie van harige wortels in B. napus en A. thaliana, die kunnen worden gebruikt om het transgen van belang rechtstreeks in harige wortelculturen te bestuderen, in de context van de hele plant met behulp van samengestelde planten, of na de regeneratie van de transgene planten.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
We erkennen Jiří Macas (Biologiecentrum CAS, České Budějovice, Tsjechië) voor het leveren van de agrobacteriële stam. De Core Facility Plants Sciences van CEITEC MU staat bekend om haar technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport van de Tsjechische Republiek met het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling-project "SINGING PLANT" (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) en het INTER-COST-project LTC20004.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.50 mL tubes | Eppendorf | 125.215 | |
| 10% solution of commercial bleach | SAVO | ||
| 1-naphthaleneacetic acid (NAA) | Duchefa | N0903 | Callus regeneration medium |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 108.132/108.078 | |
| 3M micropore tape | Micropore | ||
| 6-Benzylaminopurine (BAP) | Duchefa | B0904 | Callus regeneration medium, Shoot elongation medium |
| 70% ethanol | |||
| bacteriological agar | HiMedia | RM201 | LB medium |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | LB and YEB media |
| Beef extract | Roth | X975.1 | YEB medium |
| Bottles | DURAN | L300025 | |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
| chloroform | Serva | 3955301 | |
| CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide | Sigma | 52365 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | R0193 | |
| EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma | ES134-250G | |
| elctroporation cuvette | |||
| electrophesis agar, peqGOLD universal | VWR | 732-2789 | |
| electrophoresis chamber | BIO-RAD | ||
| electrophoresis gel reader | BIO-RAD | ||
| electroporator GenePulser Xcell | BIO-RAD | ||
| ethidium bromide | AppliChem | ||
| Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap | BIO-RAD | 1652082 | |
| Gene Ruler DNA ladder mix | Thermo Fisher Scientific | SM0331 | |
| Gibberellic acid (GA3) | Duchefa | G0907 | Shoot elongation medium |
| glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique | Merck | 1101100250 | |
| indole-3-butyric acid (IBA) | Duchefa | I0902 | Root induction medium |
| kanamycin monosulfate | Duchefa | K0126 | |
| Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid | Plant Media | V8505-100 | |
| Measuring cylinder | |||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
| Murashige and Skoog medium (MS) | Duchefa | M0237 | Medium for germination, Plant growing medium |
| Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins | Duchefa | M0231 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
| needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm | Terumo | ||
| pH meter | |||
| Phytagel | Sigma | P8169 | Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination |
| PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000) | Sigma | 9003-39-8 | |
| Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included | Sigma | D4309-250UN | |
| Retsh mill | Qiagen | ||
| sodium chloride | Lachner | 30093-APO | LB medium |
| square Petri Dishes | Corning | GOSSBP124-05 | |
| sucrose | Penta | 24970-31000 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
| Syringe filter | Carl Roth | P666.1 | Rotylabo syringe filters 0.22 µm pore size |
| thermomixer | Eppendorf | ||
| Ticarcillin disodium | Duchefa | T0180 | Hairy root growing medium |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethan | Serva | 3719003 | |
| ultrapure water | Millipore Milli-Q purified water | ||
| Yeast extract | Duchefa | Y1333 | LB medium |
References
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Christey, M. C. Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures—a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean. Plants. 11 (8), 1044 (2022).
- Petit, A., et al. Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation. Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).
- Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops. Crop improvement. , Springer. Boston, MA. (2013).
- Jedličková, V., et al. Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus). Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).
- Steinbauerová, V., Neumann, P., Macas, J. Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).
- Neumann, P., et al. Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species. Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).
- Montazeri, M., et al. A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum. Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).
- Zhang, X., et al. Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response. Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).
- Christey, M. C., Sinclair, B. K. Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation. Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).
- Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation. Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).
