Summary
В протоколе описана индукция волосистых корней с использованием первичных стеблей соцветий арабидопсиса и гипокотилей Brassica napus . Волосистые корни могут быть культивированы и использованы в качестве эксплантов для регенерации трансгенных растений.
Abstract
Волосистая трансформация корня представляет собой универсальный инструмент для биотехнологии растений у различных видов. Заражение штаммом Agrobacterium , несущим корнеиндуцирующую плазмиду (Ri), индуцирует образование волосистых корней в месте раны после переноса Т-ДНК из плазмиды Ri в геном растения. В протоколе подробно описана процедура инъекционной индукции волосистого корня у Brassica napus DH12075 и Arabidopsis thaliana Col-0. Волосистые корни могут быть использованы для анализа интересующего трансгена или обработаны для получения трансгенных растений. Среда регенерации, содержащая цитокинин-6-бензиламинопурин (5 мг/л) и ауксин 1-нафталинуксусную кислоту (8 мг/л), успешно вызывает побегообразование у обоих видов. Протокол охватывает генотипирование и селекцию регенерантов и растений Т1 для получения растений, несущих интересующий трансген и свободных от Т-ДНК из плазмиды Ri . Также изображен альтернативный процесс, приводящий к образованию композитного завода. В этом случае волосистые корни сохраняются на побеге (вместо естественных корней), что позволяет изучать трансген в волосистых корневых культурах в разрезе всего растения.
Introduction
Трансформация растений является узким местом любого генетического исследования в биологии растений. Почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens широко используется в качестве средства для доставки генов с помощью цветочного соуса или культуры тканей для получения трансформантов. A. tumefaciens инфицирует растения в месте раны и вызывает опухоли из-за переноса и интеграции Т-ДНК из плазмиды, индуцирующей опухоль (Ti), в геном растения-хозяина. В качествеэффективной системы трансформации растений обычно используют сконструированные штаммы A. tumefaciens с модифицированной Ti-плазмидой без Т-ДНК дикого типа и бинарный вектор с искусственной Т-ДНК и сайтами клонирования для вставки интересующего гена. Тем не менее, многие модельные виды и культуры не поддаются регенерации растений или регенерации in vitro или имеют длительные циклы роста, что влияет на эффективность этой системы трансформации.
Agrobacterium rhizogenes вызывает образование придаточных корней, или волосистых корней, в месте поражения после заражения растения-хозяина. Подобно A. tumefaciens, A. rhizogenes переносит Т-ДНК из корнеиндуцирующей плазмиды (Ri) в геном растения-хозяина, вызывая развитие трансгенных волосистых корней. Этот процесс контролируется в основном генами корневых онкогенных локусов (ROL) 2,3. Используя агробактериальные штаммы, несущие как плазмиду Ri, так и искусственный бинарный вектор, кодирующий интересующий ген, культуры волосатых корней были использованы для получения рекомбинантных белков, анализа функции промоторов или генов или редактирования геномов с использованием кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR)/CRISPR-ассоциированного белка 9 (Cas9)4,5,6.
В нашем протоколе используется трансконъюгантный штамм Ti-less A. tumefaciens C58C1, несущий плазмиду Ri pRiA4b7. Т-ДНК плазмиды Ri состоит из двух участков, правой и левой Т-ДНК (TR-ДНК и TL-ДНК соответственно), которые могут независимо интегрироваться в геном растения8. Использование этой системыпозволило оптимизировать длительный процесс трансформации эксплантов в сорте Brassica napus DH12075 9. Протокол, подробно описанный ниже, позволяет осуществить регенерацию выбранных волосистых корневых линий и получить растения Т1, несущие интересующий трансген и свободные от генов rol, примерно за 1 год. Инъекционная трансформация волосистого корня может быть использована и для других видов Brassicaceae, как показано на примере трансформации Arabidopsis thaliana Col-0. В то время как гипокотиль используется для трансформации B. napus, A. thaliana вводится в основной стебель соцветия.
Protocol
1. Приготовление сред и растворов
- Приготовьте гормональные исходные растворы.
- Для приготовления 50 мл исходного раствора 1-нафталинуксусной кислоты (NAA), 6-бензиламинопурина (БАТ) и индол-3-масляной кислоты (IBA) с концентрацией 5 мг/мл растворяют 250 мг порошкообразного гормона в 2 мл 1 М гидроксида натрия (NaOH) и доводят объем до 50 мл сверхчистой водой.
- Для приготовления 50 мл гиббереллиновой кислоты (ГА3) с концентрацией 1 мг/мл растворяют 50 мг порошкообразного гормона в 2 мл этанола и доводят объем до 50 мл сверхчистой воды.
- Раствор фильтруют с помощью стерильного шприцевого фильтра с размером пор 0,22 мкм и распределяют по стерильным пробиркам по 2 мл для хранения. Хранить раствор при температуре -20 °C или 4 °C, в зависимости от рекомендаций производителя.
- Приготовьте исходные растворы антибиотиков. Для 50 мл исходного раствора цефотаксима и тикарциллина динатрия с концентрацией 100 мг/мл растворяют 0,5 г порошкообразного антибиотика в 40 мл сверхчистой воды и доводят до конечного объема 50 мл. Раствор фильтруют с помощью стерильного шприцевого фильтра с размером пор 0,22 мкм и распределяют по стерильным пробиркам по 2 мл для хранения. Хранить раствор при температуре -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: В охлажденную среду всегда добавляются антибиотики и гормоны. - Приготовьте 1 л бульона Лурия (LB) среды, добавив 10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 5 г хлорида натрия (NaCl) в мерный цилиндр объемом 1 л, и отрегулируйте объем до 1 л с двойной дистиллированной водой. Отрегулируйте pH до 7,0 с помощью KOH с помощью pH-метра (следуя инструкциям производителя). Раствор переносят во флакон объемом 1 л и добавляют 15 г бактериологического агара (1,5%), если готовится твердая среда и автоклавируют среду. При необходимости в охлажденную среду добавляют соответствующие антибиотики (бактериальная резистентность переносится бинарным вектором).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте автоклав для стерилизации раствора. Поместите флакон в корзину, закройте крышкой и стерилизуйте в течение 20 минут при температуре 121 °C и 98,9 кПа. Этот протокол всегда используется для автоклавных растворов на дальнейших этапах. - Приготовьте 1 л среды с дрожжевым экстрактом говядины (YEB), смешав 5 г говяжьего экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г пептона, 5 г сахарозы и 0,5 г хлорида магния (MgCl2) с двойной дистиллированной водой. Отрегулируйте объем до 1 л. Перелейте раствор в бутылку объемом 1 л. Автоклавирование среды.
- Приготовьте 1 л среды для проращивания семян, смешав 2,2 г порошка Мурасиге и Скуга (МС), 10 г сахарозы (1%) и 0,5 г натриевых солей 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (МЭС) с двойной дистиллированной водой. Отрегулируйте объем до 1 л, перемешайте и отрегулируйте pH до 5,8 с помощью KOH. Перелейте раствор в бутылку объемом 1 л и добавьте 8 г растительного агара (0,8%). Автоклавирование среды.
- Приготовьте 1 л питательной среды для растений, смешав 2,2 г порошка MS, 5 г сахарозы (0,5%) и 0,5 г солей MES с двойной дистиллированной водой. Отрегулируйте объем до 1 л, перемешайте и отрегулируйте pH до 5,8 с помощью KOH. Перелейте раствор в бутылку объемом 1 л и добавьте 8 г растительного агара (0,8 %). Автоклавирование среды.
- Приготовьте 1 л волосистой корневой питательной среды, смешав 4,4 г порошка витаминов MS + B5, 30 г сахарозы (3%) и 0,5 г солей MES в дважды дистиллированной воде. Отрегулируйте объем до 1 л, перемешайте и отрегулируйте pH до 5,8 с помощью KOH и перелейте раствор в бутылку объемом 1 л. Добавьте 3 г желирующего агента (0,3%) и автоклавируйте среду. Добавьте цефотаксим и тикарциллин динатрий до конечной концентрации 100 - 200 мг/л и 100 - 500 мг/л соответственно. При необходимости добавляют соответствующие антибиотики (резистентность обусловлена Т-ДНК бинарного вектора).
- Приготовьте 1 л композитной питательной среды для растений, смешав 2,2 г порошка витаминов MS + B5, 10 г сахарозы (1%) и 0,5 г солей MES в дважды дистиллированной воде. Отрегулируйте объем до 1 л, перемешайте, отрегулируйте pH до 5,8 с помощью KOH и перелейте раствор в бутылку объемом 1 л. Добавьте 6 г желирующего агента (0,6%) и автоклавируйте среду. Добавьте цефотаксим и тикарциллин динатрий до конечной концентрации 200 мг/л и 500 мг/л соответственно. При необходимости добавляют соответствующие антибиотики (резистентность обусловлена Т-ДНК бинарного вектора).
- Приготовьте 1 л регенеративной среды, смешав 4,4 г порошка витаминов МС+В5, 30 г сахарозы (3%) и 0,5 г солей МЭС с двойной дистиллированной водой. Отрегулируйте объем до 1 л, перемешайте и отрегулируйте pH до 5,8 с помощью KOH. Перелейте раствор в бутылку объемом 1 л и добавьте 3 г желирующего агента (0,3 %). Автоклавирование среды. Добавьте NAA и BAP до конечной концентрации 8 мг/л и 5 мг/л соответственно и тикарциллин динатрий до конечной концентрации 100 мг/л.
- Приготовьте 1 л среды для удлинения побегов, смешав 4,4 г порошка витаминов МС+В5, 20 г сахарозы (2%) и 0,5 г солей МЭС с двойной дистиллированной водой. Отрегулируйте объем до 1 л, перемешайте и отрегулируйте pH до 5,8 с помощью KOH. Перелейте раствор в бутылку объемом 1 л и добавьте 3 г растительного агара (0,3%). Автоклавирование среды. Добавьте БАТ и ГА3 до конечной концентрации 0,5 мг/л и 0,03 мг/л соответственно и цефотаксим до конечной концентрации 100 мг/л.
- Приготовьте 1 л корневой индукционной среды, смешав 2,2 г порошка витаминов MS + B5, 10 г сахарозы (1%) и 0,5 г солей MES с двойной дистиллированной водой. Отрегулируйте объем до 1 л, перемешайте и отрегулируйте pH до 5,8 с помощью KOH. Перелейте раствор в бутылку объемом 1 л и добавьте 3 г желирующего агента (0,3%). Автоклавирование среды. Добавьте IBA и цефотаксим до конечной концентрации 0,5 мг/л и 100 мг/л соответственно.
- Приготовьте 1 л цетилтриметиламмония бромида (CTAB) буфера, добавив 20 г CTAB (2% по сравнению с окончательным результатом), 100 мл 1M Tris-HCl, pH 8,0 (100 мМ конечного), 40 мл 0,5 М ЭДТА, pH 8,0 (20 мМ конечного), 81,8 г NaCl (1,4 М конечного) и 5 г PVP40 (0,5% с окончательным результатом). Доведите до 1 л двойной дистиллированной водой. Автоклавируйте раствор. Хранить раствор до 1 года при комнатной температуре.
2. Трансформация агробактерии бинарным вектором
- Подготовьте ДНК верифицированной бинарной плазмиды, содержащей кассету Т-ДНК, для интеграции в геном растения. Убедитесь, что плазмидная ДНК содержит мало солей, чтобы избежать электрических искр при использовании электропорации. Рекомендуется использовать набор для экстракции плазмидной ДНК по выбору.
- Электрокомпетентные клетки Agrobacterium tumefaciens C58C1, содержащие плазмиду, индуцирующую волосистый корень, pRiA4b , подготавливают 200 мл предварительно нагретой (28 °C) жидкости YEB 8 мл свежей ночной культуры. Инкубируйте культуру при 28 °C при встряхивании до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм (OD600) не станет около 0,5, что соответствует средней логарифмической фазе. Это займет около 4 - 5 часов.
- Разделите культуру Agrobacterium на четыре предварительно охлажденные стерильные центрифужные пробирки объемом 50 мл. Центрифуга в течение 15 мин при 4 °C при 3 200 x g.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, клетки должны храниться в холоде. - Удалите надосадочную жидкость и осторожно суспендируйте гранулу в (4x) 2,5 мл холодного (4 °C) 10% глицерина. Добавьте еще 47,5 мл холодного 10% глицерина и аккуратно перемешайте.
- Грануляторы при 3 200 x g в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в (4x) 10 мл холодного 10% глицерина.
- Снова гранулируйте клетки и повторно суспендируйте их в (4x) 0,75 мл холодного 10% глицерина. Объедините содержимое всех четырех пробирок в одну (общий объем = 3 мл).
- Разделяют агробактериальный раствор на аликвоты по 50 мкл в предварительно охлажденных стерильных микропробирках по 1,5 мл. Заморозьте аликвоты на сухом льду или жидком азоте. Храните пробирки при температуре -80 °C для использования в будущем.
- Поместите одну пробирку компетентных клеток (50 мкл) на лед, смешайте с 5 мкл плазмидной ДНК (всего 1 мкг, начиная с шага 2.1), перелейте смесь в электропорационную кювету (зазор 0,2 см) и инкубируйте в течение 5 мин на льду.
- Поместите кювету в электропоратор и электропорируйте ячейки со следующими настройками: емкость 25 мкFD, сопротивление 400 Ω, электрическое напряжение 2,5 кВ, длительность импульса 9,7 мс.
- Добавьте 950 мкл жидкой среды LB в клетки, которые затем культивируют при 28 °C в течение 2 ч при 300 об/мин в термомиксере. Распределите 50 мкл клеточной культуры на твердую среду LB с соответствующим селективным антибиотиком. Культивируйте планшеты в течение 2 дней при температуре 28 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется наносить различные клеточные культуры (10 мкл - 100 мкл) на пробирку, чтобы определить надлежащий объем культуры и избежать чрезмерного роста бактерий. - Готовят жидкие культуры из нескольких отобранных колоний в 5 мл жидкой среды LB с антибиотиками. Выращивайте бактерии в течение ночи при температуре 28 °C при встряхивании. Используйте эти культуры для запасов глицерина, смешивая 0,5 мл жидкой бактериальной культуры и 0,5 мл 40% глицерина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти колонии проверяются на наличие трансгена с помощью ПЦР колонии. Для этого добавляют небольшое количество колонии из планшета в мастер-смесь ПЦР, содержащую буфер, dNTP и Taq-полимеразу по выбору, вместе с праймерами, амплифицирующими часть Т-ДНК из бинарного вектора. Посевной материал из запасов глицерина используется для трансформации растений.
3. Волосистая трансформация корня Brassica napus DH12075
- Поместите семена Brassica napus DH12075 в микропробирки и стерилизуйте их в флоубоксе. Сначала обезжирьте семена водой и 0,1% моющим средством, встряхивая в течение 60 с. Затем промойте семена водой, а затем 70% этиловым спиртом, оба в течение 60 с.
- Стерилизуют семена, используя 10% раствор товарного отбеливателя, содержащего гипохлорит натрия. Встряхивайте семена в этом растворе в течение 20 минут.
- Промойте семена 4 раза стерильной водой в течение 60 с каждое. Поместите их в чашки Петри, содержащие среду для прорастания семян. Семена следует стратифицировать в холодном режиме при температуре 4 °C в течение ночи и переместить планшеты в помещение для выращивания (21 °C, 16 часов света / 8 часов темноты).
- Перенесите 5-дневную рассаду в ящики для культуры растений, содержащие питательную среду для растений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшая эффективность трансформации в DH12075 была выявлена для 18-дневной рассады. Возраст саженцев может быть оптимизирован для местных условий произрастания или других сортов. - Инокулируют жидкую культуру Agrobacterium tumefaciens C58C1 , несущую волосистую плазмиду pRiA4b , индуцирующую корень, и бинарный вектор для трансформации (из шага 2.11) с помощью инокуляционной петли. Используйте 5 мл LB medium. Выращивайте эту культуру в течение ночи при 28 °C, пока она не достигнет OD600 = 0,9 - 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Агробактерии, содержащие только плазмиду Ri , используются, если образуются волосистые корни дикого типа. - Ввести небольшое количество культуры (примерно 50 мкл) с помощью инсулинового шприца в гипокотиль 18-дневного саженца (с шага 3.4.). Проколите гипокотиль иглой 26G, установленной на шприце на высоте около 1 см над поверхностью среды. Введите жидкость в рану. Ткань на поверхности гипокотиля также может быть поцарапана шприцем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество привитых саженцев должно быть адаптировано к потребностям экспериментатора. - Верните растения в помещение для культивации при температуре 21 °C на 2-4 недели до тех пор, пока на месте раны не образуются каллус и волосистые корни.
- Срежьте каллус с появившимися волосистыми корнями от гипокотиля и поместите его в чашку Петри с волосистой корневой питательной средой, содержащей селективные антибиотики (переносимые Т-ДНК) и цефотаксим (200 мг/л) и тикарциллин (500 мг/л) для подавления роста агробактерий. Заклейте чашки Петри газопроницаемой лентой. Культивируйте волосистые корни при температуре 24 °C в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Надлежащая концентрация специфических антибиотиков, используемых для функционального отбора, должна быть проверена на волосистых корнях дикого типа. Для B. napus DH12075 волосистыми корнями, несущими резистентность к канамицину, применяют концентрацию канамицина 25 мг/л.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно создать сложное растение, состоящее из побега дикого типа и трансгенных волосистых корней, поддерживающих рост такого растения. Вместо того, чтобы срезать волосистые корни со стебля, удаляют родные корни растения. Растение с появляющимися волосистыми корнями переносят в ящик для культивирования растений с композитной питательной средой, содержащей цефотаксим (200 мг/л) и тикарциллин (500 мг/л) для подавления роста агробактерий и селективный антибиотик (переносимый Т-ДНК). - Через 1 – 2 недели изолируют волосистые корни на чашке Петри от каллуса и индивидуализируют их на планшетах с той же питательной средой. Пересаживайте культуру на свежую тарелку каждые 4 – 5 недель. Добавьте 0,25 мг/л ИМК для увеличения ветвления корней.
- Снижают концентрации цефотаксима и тикарциллина постепенно при каждом переносе на 100 мг/л (т.е. среда для первого переноса содержит 100 мг/л цефотаксима и 400 мг/л тикарциллина; для второго переноса — 300 мг/л тикарциллина и т. д.). Через 3-4 месяца культивируйте волосистые корни на волосистой питательной среде с тикарциллином в дозе 100 мг/л и селективным антибиотиком.
4. Регенерация Brassica napus DH12075 волосистыми корнями
- Независимые волосистые корневые линии переносят на пластины со средой регенерации в стерильных условиях с помощью пинцета, перед применением поджигают. Пересадите 5 - 10 корней в чашку Петри и культивируйте их при 21 °C в фотопериод длинного дня (16 ч света / 8 ч темноты). Заклейте чашки Петри газопроницаемой лентой.
- Каждые 3-4 недели пересаживайте волосистые корни на пластины со свежей средой регенерации. Обратите внимание, что каллусы образуются примерно через 2 недели. Костная мозоль начинает стрелять еще через 2 недели и до 8 - 9 недель после образования мозолей.
- Индивидуализируйте побеги и перенесите их в ящики для культуры растений со средой удлинения побегов на 2-3 недели, чтобы способствовать удлинению побегов.
- Вытянутые побеги переносят в ящики для культуры растений с корневой индукционной средой. Обновляйте культуру каждые 3 – 4 недели. Эффективность укоренения в DH12075 составляет 87% через 30 дней и до 100% через 60 дней.
- Перенесите укоренившиеся растения в почву после удаления следов желирующего агента, чтобы предотвратить грибковую инфекцию. Убедитесь, что растения сначала акклиматизированы в фитотронах (21 °C, фотопериод длинного дня, 150 мкЭ), а затем перенесите их в теплицу для цветения (21 °C / 18 °C, фотопериод длинного дня, 150 мкЭ).
5. Выбор регенеранта и установки Т1
ПРИМЕЧАНИЕ: Волосистые корневые линии могут быть выбраны до начала процесса регенерации. Тип отбора зависит от содержания, переносимого трансгеном. Волосистые корни могут быть отобраны для экстракции ДНК и генотипирования или выявления мутаций, экстракции РНК с последующим синтезом кДНК и ОТ-кПЦР для анализа на уровне экспрессии гена выбора, микроскопии для обнаружения флуоресценции или обработаны для окрашивания ГУС.
- После переноса в почву повторно генотипируют растения-регенеранты Т0 (и сеянцы Т1), чтобы избежать побегов из селекционных процедур. Растения T0 демонстрируют измененный фенотип, называемый фенотипом Ri: обширный рост корней, курчавые листья и карликовые побеги, вызванные присутствием TL и/или TR-ДНК плазмиды Ri , вставленной в геном растения.
- Чтобы ускорить селекцию Т1, используйте семена, содержащие зеленые зрелые эмбрионы (примерно через 21 - 28 дней после опыления для DH12075 для эмбриона торпеды или старше) из растений-регенерантов Т0 для спасения эмбрионов.
- Работа в стерильном поточном боксе. Соберите силики и стерилизуйте их поверхность 70% этанолом.
- Поместите их на двусторонний скотч, приклеенный скотчем к крышке тарелки или слайду.
- С помощью стереобинокля разрежьте кремнезем по краям клапана с помощью иглы 26G. Следите за тем, чтобы срез не повредил семена. Для удобства захвата установите иглу на шприц объемом 1 мл.
- Раскройте плодолистики и приклейте их к ленте. Соберите недозревшие семена и переложите их на тарелки со средой для прорастания семян. Заклейте пластины газопроницаемой лентой.
- Поместите планшеты в помещение для культивации (21 °C, 16 часов света / 8 часов темноты) до появления всходов.
- Генотип проростков Т1 на наличие интересующего трансгена и отсутствие Ri TR/TL (рис. 1). Соберите материал листьев и извлеките их ДНК выбранным методом. Метод CTAB описан здесь:
- Соберите листовой материал в микропробирку объемом 2 мл, содержащую две керамические шарики. Заморозьте трубку в жидком азоте.
- Измельчите материал с помощью шаровой мельницы. В качестве альтернативы можно использовать пестик и ступку.
- После быстрого отжима добавьте в порошок 400 мкл буфера CTAB. Ненадолго взболтайте, открутите вниз и инкубируйте при 60 °C не менее 50 минут.
- Остудить раствор до комнатной температуры в течение 15 мин. Добавьте один объем хлороформа и аккуратно перемешайте.
ВНИМАНИЕ: При использовании хлороформа работайте под потоком химикатов и используйте перчатки для защиты. Любой раствор, содержащий хлороформ, следует выбрасывать в соответствующий мусорный бак. - Центрифуга в течение 5 мин при 18 400 x g с помощью настольной центрифуги. Переносят 250 - 350 мкл верхней водной фазы в новую микропробирку. Опустите интерфазу.
- Добавьте один объем изопропанола, хорошо перемешайте и выдержите 5 минут при комнатной температуре. Центрифуга в течение 40 мин при 18 400 x g.
- Слейте жидкость и добавьте 200 мкл 70% этанола. Промывайте гранулы и центрифугу в течение 15 минут при 18 400 x g.
- Слейте жидкость. Высушите гранулу на воздухе и добавьте 50 - 100 мкл сверхчистой воды. Дайте ДНК раствориться в течение 1 часа или ночи в холодильнике.
- Выполните генотипирование методом ПЦР для гена rolA (TL), гена aux1 (TR) и локуса virC (Agrobacterium). Готовят реакцию ПЦР с использованием подготовленной ДНК (из шага 5.3.), праймеров, буфера, dNTP и Taq-полимеразы в соответствии с протоколом производителя. Амплифицированные фрагменты имеют длину 200 - 500.н.
Праймеры, специфичные для rolA:
Нападающий: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAG
Реверс: TGCGTATTAATCCCGTAGGTC
Праймеры, специфичные для aux1:
Вперед: CATAGGATCGCCTCACAGGT
Реверс: CGTTGCTTGATGTCAGGAGA
Праймеры, специфичные для virC:
Вперед: AATGCGTCTCTCTCGTGCAT
Реверс: AAACCGACCACTAACGCGGAT
Примечание: Перенос и интеграция Т-ДНК могут быть частичными, и только части TL и/или TR могут интегрироваться в геном. Таким образом, рекомендуется проанализировать наличие других ORF TL (например, rolB и rolC) и TR (aux2, mas1, ags1) в проростках Т1. Последовательности праймеров, специфичные для этих локусов, перечислены в Jedličková et al.9. - Оценка реакций ПЦР методом гель-электрофореза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется включить положительный контроль в этот анализ, чтобы убедиться в наличии ДНК ПЦР-класса. - Отбирают на наличие (или отсутствие) трансгена по протоколам, основанным на содержании этого трансгена.
- Перенесите выбранную рассаду в почву.
6. Трансформация и регенерация волосистых корней у Arabidopsis thaliana Col-0
- Стерилизовать семена A. thaliana с поверхности любым способом (отбеливатель, этанол или газообразный хлор).
- Пластинчатые стерильные семена на среде для проращивания семян. После 2 суток холодной стратификации переместите планшеты в помещение для культивации (21 °C с фотопериодом длинного дня и влажностью 50%).
- Перенесите 1-недельную рассаду в ящик для культуры растений с питательной средой для растений.
- Подготовьте агробактериальные культуры, как указано в шаге 3.5.
- Ввести небольшое количество культуры (примерно 50 мкл) иглой, установленной на инсулиновом шприце, у основания первичного стебля соцветия (примерно на 1 – 2 см выше розетки) 1-месячных проростков арабидопсиса . Ткань на поверхности первичного стержня также может быть поцарапана шприцем.
- Через 2-4 недели после инъекции удаляют появляющиеся волосистые корни и культивируют их на чашках Петри с волосистой средой для роста корней, дополненной селективным антибиотиком (переносимым Т-ДНК) и цефотаксимом (200 мг/л) и тикарциллином (500 мг/л) для подавления роста агробактерий. Инкубируйте планшеты при температуре 24 °C в темноте.
- Через 1 – 2 недели индивидуализировать волосистые корни на пластинах с той же питательной средой. Пересаживайте выбранные волосистые корневые линии на свежую среду каждые 4 – 5 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Волосистые корни A. thaliana тоньше, чем у B. napus, и необходимо соблюдать осторожность при переносе на свежую среду. - Перенесите волосистые корни на пластины с регенерирующей средой, чтобы вызвать образование каллуса. Культивируйте планшеты при температуре 21 °C в фотопериод длинного дня (16 ч светлый / 8 ч темный).
- Побеги появляются из каллуса через 18 – 21 день выращивания. Обрежьте побеги и перенесите их в среду для удлинения побегов на 2 - 3 недели, чтобы стимулировать рост и удлинение.
- Вытянутые побеги перенесите в корневую индукционную среду.
- Перенесите укоренившиеся растения в почву. Растения T0 также имеют фенотип Ri. Проведите трансгенный отбор, как описано для B. napus DH12075 (шаг 5).
Representative Results
Ранее мы оптимизировали протокол индукции волосистого корня на основе инъекций у трех сортов Brassica napus, а именно DH12075, Topas DH4079 и Westar9. Для применения этого протокола трансформации к модельному виду A. thaliana первичным стеблям соцветий 1-месячных сеянцев вводили агробактериальный инокулюм. Волосистые корни появились на месте инъекции через 2-4 недели. Волосистые корни иссекали и культивировали на твердой среде. Сравнение метода у этих двух видов изображено на рисунке 1.
Отобранные волосистые корневые линии переносили в среду регенерации, чтобы стимулировать образование побегов. У A. thaliana желтые каллусы индуцировались в течение 14 дней во всех 10 исследованных волосистых корневых линиях. Зачатки первых побегов видны в виде темно-зеленых пятен, появившихся в течение 3 недель после переноса в среду регенерации (рис. 2). Через 4 недели культуры побеги покрыли волосистые корни в 9 из 10 волосистых корневых линий (эффективность регенерации 90%). В некоторых случаях из каллуса выделялись придаточные корни (рис. 2H). Одна линия не регенерировала даже через 3 месяца на среде Regeneration (каждые 4 недели волосистые корни пересаживались на свежую среду). Таким образом, эффективность регенерации волосистых корней A. thaliana сходна с эффективностью B. napus DH120759.
Волосистые корневые регенеранты B. napus и A. thaliana демонстрируют карликовый фенотип (рис. 3), что является типичной чертой волосистых корневых растений2. Мы также наблюдали густую корневую систему, морщинистые листья и изменения во времени цветения. Этот так называемый фенотип волосистого корня (или Ri) обусловлен генами rol плазмиды Ri , вставленными в геном растения. Вставка Ri Т-ДНК и трансгена, кодируемого на бинарном векторе, может быть независимой или сцепленной. Таким образом, сегрегационный анализ потомства Т1, созданного путем самоопыления, помогает идентифицировать растения без рулонов, экспрессирующие интересующий трансген. Генотипирование растений Т1 проводят с помощью ПЦР-праймеров, специфичных для ORF TL и TR и интересующего трансгена. Отсутствие агробактериальной обсемененности проверяется отсутствием продуктов ПЦР праймеров virC (рис. 1).
Рисунок 1: Краткое описание процедуры у A. thaliana и B. napus. Инъекция Agrobacterium inoculum в стебель гипокотиля или первичного соцветия вызывает развитие волосистых корней. Волосатые корни могут заменить родные корни, чтобы создать сложное растение, которое будет генотипировано и проанализировано (синие стрелки). Культивируемые волосистые корни могут быть регенерированы в растения Т0, размножаться в растениях Т1 и генотипированы (зеленые стрелки). Волосатые корни также могут быть субкультивированы для функционального анализа (черная стрелка). Приведены примеры результатов генотипирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Регенерация волосистых корней у A. thaliana. (А) Волосистая корневая культура через 1 сутки после ее переноса на пластины. (В, В) Каллусы развивались в течение 2 недель культивирования на регенерационной среде. (Г, Д) Побег зачатков появился через 3 недели культивирования. (Г, Н) Всходы образуются через 4 недели. (H) Придаточные корни развились из каллуса. (С, Ж, И) Нерегенерирующая волосистая корневая линия. Масштабные линейки обозначают 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные фотографии дикорастущих растений B. napus и A. thaliana и регенерантов с волосистыми корнями (растения T0). Обратите внимание на фенотип Ри регенерантов. Масштабные линейки обозначают 2 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Мы разработали простой протокол трансформации волосистого корня и последующей регенерации у B. napus и A. thaliana. Этот процесс включает в себя инъекционную индукцию волосистого корня в гипокотиль (B. napus) или первичный стебель соцветия (A. thaliana). Метод введения в гипокотиль агробактериального штамма C58C1, несущего плазмиду Ri, был эффективен также в семействе Fabaceae10,11, помимо представителей семейства Brassicaceae, представленных в данном исследовании.
Альтернативой инъекционному методу является иммерсионная трансформация, состоящая из погружения экспланта в бактериальную суспензию с последующим совместным культивированием экспланта с агробактериями. Преимущество инъекционного метода перед иммерсионным заключается в экономии времени за счет отсутствия некоторых протокольных этапов: подготовки экспланта, теста времени совместного культивирования и культивирования на среде, содержащей гормон для индукции волосистых корней. Несмотря на то, что оба подхода эффективны для индукции волосистого корня, у некоторых видов наблюдалась более высокая эффективность трансформации при инъекционном методе по сравнению с эксплант-иммерсионным12,13. Кроме того, инъекционная трансформация также полезна для получения сложных растений (трансгенных волосистых корней и побегов дикого типа). После отрезания первоначальных корней трансформированного растения волосистые корни поддерживают рост растения, и трансген может быть изучен в контексте всего растения.
Критическим этапом индукции волосистого корня является введение посевного материала в гипокотиль, или первичный стебель соцветия. Гипокотили B. napus хрупкие, и разрезание всего гипокотиля может легко произойти. То же самое можно наблюдать и с A. thaliana из-за тонкости стебля соцветия. Если требуется сравнение эффективности трансформации разных видов/сортов, мы рекомендуем одному человеку проводить все эксперименты, чтобы избежать ошибки, вызванной манипуляциями и навыками введения растений.
Разработан эффективный протокол регенерации волосистых корней у B. napus DH12075 и A. thaliana Col-0. Поскольку регенерация является очень изменчивым процессом, некоторые модификации протокола могут быть применены к выбранному виду или сорту. Например, волосистые корневые побеги могут быть вызваны другим соотношением ауксин/цитокинин (1:1) у B. oleracea14. В качестве альтернативы вместо БАТ можно использовать цитокинин тидиазурон, например, в случае волосистых корней B. campestris 15.
Множественные вставки Т-ДНК плазмиды Ri в геном растения представляют собой потенциальное ограничение системы трансформации и регенерации корня волоса. В таких случаях после сегрегационного анализа проростков Т1 не обнаруживается ни одного растения, свободного от TL/TR из плазмиды Ри. Таким образом, мы рекомендуем генерировать несколько независимых волосистых корневых линий для каждого трансгена.
Волосистые корневые культуры являются чрезвычайно мощным инструментом для функциональных исследований генов, главным образом из-за их быстрого укоренения и дешевого обслуживания (в питательных средах не требуются гормоны). Этот протокол охватывает методы индукции и регенерации волосистых корней у B. napus и A. thaliana, которые могут быть использованы для изучения интересующего трансгена непосредственно в волосистых корневых культурах, в контексте всего растения с использованием сложных растений или после регенерации трансгенных растений.
Disclosures
Авторы заявляют, что исследование проводилось без каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Acknowledgments
Выражаем благодарность Йиржи Макасу (Jiří Macas) (Биологический центр CAS, Ческе-Будеёвице, Чешская Республика) за предоставление агробактериального штамма. Отдел наук о базовых установках CEITEC MU получил признание за свою техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством образования, молодежи и спорта Чешской Республики совместно с Европейским фондом регионального развития-проектом «ПОЮЩЕЕ РАСТЕНИЕ» (no. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) и проект INTER-COST LTC20004.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.50 mL tubes | Eppendorf | 125.215 | |
| 10% solution of commercial bleach | SAVO | ||
| 1-naphthaleneacetic acid (NAA) | Duchefa | N0903 | Callus regeneration medium |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 108.132/108.078 | |
| 3M micropore tape | Micropore | ||
| 6-Benzylaminopurine (BAP) | Duchefa | B0904 | Callus regeneration medium, Shoot elongation medium |
| 70% ethanol | |||
| bacteriological agar | HiMedia | RM201 | LB medium |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | LB and YEB media |
| Beef extract | Roth | X975.1 | YEB medium |
| Bottles | DURAN | L300025 | |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
| chloroform | Serva | 3955301 | |
| CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide | Sigma | 52365 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | R0193 | |
| EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma | ES134-250G | |
| elctroporation cuvette | |||
| electrophesis agar, peqGOLD universal | VWR | 732-2789 | |
| electrophoresis chamber | BIO-RAD | ||
| electrophoresis gel reader | BIO-RAD | ||
| electroporator GenePulser Xcell | BIO-RAD | ||
| ethidium bromide | AppliChem | ||
| Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap | BIO-RAD | 1652082 | |
| Gene Ruler DNA ladder mix | Thermo Fisher Scientific | SM0331 | |
| Gibberellic acid (GA3) | Duchefa | G0907 | Shoot elongation medium |
| glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique | Merck | 1101100250 | |
| indole-3-butyric acid (IBA) | Duchefa | I0902 | Root induction medium |
| kanamycin monosulfate | Duchefa | K0126 | |
| Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid | Plant Media | V8505-100 | |
| Measuring cylinder | |||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
| Murashige and Skoog medium (MS) | Duchefa | M0237 | Medium for germination, Plant growing medium |
| Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins | Duchefa | M0231 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
| needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm | Terumo | ||
| pH meter | |||
| Phytagel | Sigma | P8169 | Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination |
| PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000) | Sigma | 9003-39-8 | |
| Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included | Sigma | D4309-250UN | |
| Retsh mill | Qiagen | ||
| sodium chloride | Lachner | 30093-APO | LB medium |
| square Petri Dishes | Corning | GOSSBP124-05 | |
| sucrose | Penta | 24970-31000 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
| Syringe filter | Carl Roth | P666.1 | Rotylabo syringe filters 0.22 µm pore size |
| thermomixer | Eppendorf | ||
| Ticarcillin disodium | Duchefa | T0180 | Hairy root growing medium |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethan | Serva | 3719003 | |
| ultrapure water | Millipore Milli-Q purified water | ||
| Yeast extract | Duchefa | Y1333 | LB medium |
References
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Christey, M. C. Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures—a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean. Plants. 11 (8), 1044 (2022).
- Petit, A., et al. Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation. Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).
- Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops. Crop improvement. , Springer. Boston, MA. (2013).
- Jedličková, V., et al. Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus). Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).
- Steinbauerová, V., Neumann, P., Macas, J. Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).
- Neumann, P., et al. Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species. Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).
- Montazeri, M., et al. A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum. Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).
- Zhang, X., et al. Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response. Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).
- Christey, M. C., Sinclair, B. K. Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation. Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).
- Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation. Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).
