Summary
Protokollet beskriver induktion av håriga rötter med hjälp av Arabidopsis primära blomställningsstjälkar och Brassica napus hypocotyls. De håriga rötterna kan odlas och användas som explantat för att regenerera transgena växter.
Abstract
Omvandling av håriga rötter är ett mångsidigt verktyg för växtbioteknik hos olika arter. Infektion av en Agrobacterium-stam som bär på en rotinducerande (Ri) plasmid inducerar bildandet av håriga rötter på sårstället efter överföringen av T-DNA från Ri-plasmiden till växtgenomet. Protokollet beskriver i detalj proceduren för den injektionsbaserade induktionen av hårig rot i Brassica napus DH12075 och Arabidopsis thaliana Col-0. De håriga rötterna kan användas för att analysera en transgen av intresse eller bearbetas för generering av transgena växter. Regenereringsmedium som innehåller cytokinin 6-bensylaminopurin (5 mg/L) och auxin 1-naftalenättiksyra (8 mg/L) framkallar framgångsrikt skottbildning hos båda arterna. Protokollet omfattar genotypning och urval av regeneranter och T1-växter för att erhålla växter som bär på en transgen av intresse och fri från T-DNA från Ri-plasmiden. En alternativ process som leder till bildandet av en kompositväxt avbildas också. I det här fallet hålls håriga rötter på skottet (istället för de naturliga rötterna), vilket gör det möjligt att studera en transgen i håriga rotkulturer i samband med hela växten.
Introduction
Växtomvandling är flaskhalsen i alla genetiska studier inom växtbiologi. En jordburen bakterie, Agrobacterium tumefaciens, används ofta som ett medel för genleverans genom blomdopp eller vävnadsodling för att generera transformanter. A. tumefaciens infekterar växter på ett sårställe och orsakar tumörer på grund av överföring och integration av T-DNA från en tumörinducerande (Ti) plasmid till värdväxtens genom. Konstruerade A. tumefaciens-stammar med modifierad Ti-plasmid utan vildtyps-T-DNA och en binär vektor med artificiellt T-DNA och kloningsställen för att infoga en gen av intresse används ofta som ett effektivt växttransformationssystem1. Många modellarter och grödor är dock motsträviga mot blomdoppning eller in vitro-växtföryngring eller har långa tillväxtcykler, vilket påverkar effektiviteten i detta omvandlingssystem.
Agrobacterium rhizogenes inducerar bildandet av adventivrötter, eller hårrötter, på sårstället efter att ha infekterat en värdväxt. I likhet med A. tumefaciens överför A. rhizogenes ett T-DNA från en rotinducerande (Ri) plasmid till värdväxtens genom, vilket orsakar utvecklingen av transgena håriga rötter. Denna process styrs huvudsakligen av rotens onkogena loci (rol) gener 2,3. Med hjälp av agrobakteriella stammar som bär både Ri-plasmiden och en artificiell binär vektor som kodar för en gen av intresse, har håriga rotkulturer använts för att producera rekombinanta proteiner, analysera funktionen hos promotorer eller gener eller redigera genom med hjälp av Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associerat protein 9 (Cas9)4,5,6.
Vårt protokoll använder den transkonjuganta stammen Ti-less A. tumefaciens C58C1 som bär på Ri-plasmiden pRiA4b7. T-DNA i Ri-plasmiden består av två regioner, höger och vänster T-DNA (TR-DNA respektive TL-DNA), som oberoende av varandra kan integreras i växtgenomet8. Genom att utnyttja detta system optimerades den långa explanteringsomvandlingsprocessen i Brassica napus DH12075 sort9. Protokollet som beskrivs nedan möjliggör regenerering av utvalda håriga rotlinjer och erhållande av T1-plantor som bär transgenen av intresse och fria från rolgener på ungefär 1 år. Den injektionsbaserade håriga rotomvandlingen kan användas i andra Brassicaceae-arter, vilket visas genom att transformera Arabidopsis thaliana Col-0. Medan hypokotyl används för att omvandla B. napus, injiceras A. thaliana i den primära blomställningsstammen.
Protocol
1. Beredning av medier och lösningar
- Bered hormonstamlösningarna.
- För beredning av 50 ml 1-naftalenättiksyra (NAA), 6-bensylaminopurin (BAP) och indol-3-smörsyra (IBA) stamlösning med en koncentration av 5 mg/ml, lös 250 mg av det pulveriserade hormonet i 2 ml 1 M natriumhydroxid (NaOH) och justera volymen till 50 ml med ultrarent vatten.
- För att bereda 50 ml gibberellsyra (GA3) med en koncentration av 1 mg/ml, lös upp 50 mg av det pulveriserade hormonet i 2 ml etanol och justera volymen till 50 ml ultrarent vatten.
- Filtrera lösningen med ett sterilt sprutfilter med en porstorlek på 0,22 μm och fördela den i sterila 2 ml rör för förvaring. Förvara lösningen vid -20 °C eller 4 °C, beroende på tillverkarens rekommendation.
- Bered stamlösningar för antibiotika. För 50 ml stamlösning av cefotaxim och tikarcillindinatrium med en koncentration på 100 mg/ml, lös upp 0,5 g av antibiotikumet i pulverform i 40 ml ultrarent vatten och justera till en slutlig volym på 50 ml. Filtrera lösningen med ett sterilt sprutfilter med en porstorlek på 0,22 μm och fördela den i sterila 2 ml rör för förvaring. Förvara lösningen vid -20 °C.
OBS: Antibiotika och hormoner tillsätts alltid till det kylda mediet. - Bered 1 l Luria buljong (LB) medium genom att tillsätta 10 g bak-trypton, 5 g jästextrakt och 5 g natriumklorid (NaCl) i ett 1 L mätglas och justera volymen till 1 L med dubbelt destillerat vatten. Justera pH till 7.0 med KOH med en pH-mätare (följ tillverkarens instruktioner). Överför lösningen till en 1 L flaska och tillsätt 15 g bakteriologisk agar (1,5 %), om ett fast medium bereds och autoklavera mediet. Tillsätt vid behov lämplig antibiotika (bakterieresistens bärs på den binära vektorn) till det kylda mediet.
OBS: Använd en autoklav för att sterilisera lösningen. Lägg flaskan i korgen, stäng locket och sterilisera den i 20 minuter vid 121 °C och 98,9 kPa. Detta protokoll används alltid för autoklavering av lösningar i ytterligare steg. - Förbered 1 L jästextrakt nötkött (YEB) medium genom att blanda 5 g nötköttsextrakt, 1 g jästextrakt, 5 g pepton, 5 g sackaros och 0.5 g magnesiumklorid (MgCl2) i dubbeldestillerat vatten. Justera volymen till 1 L. Överför lösningen till en 1 L flaska. Autoklavera mediet.
- Bered 1 liter medium för frögroning genom att blanda 2,2 g Murashige och Skoog (MS) pulver, 10 g sackaros (1%) och 0,5 g 2-(N-Morpholino)etansulfonsyra (MES) natriumsalter i dubbeldestillerat vatten. Justera volymen till 1 L, blanda och justera pH till 5.8 med KOH. Överför lösningen till en 1 L flaska och tillsätt 8 g växtagar (0,8%). Autoklavera mediet.
- Bered 1 l växtmedium genom att blanda 2,2 g MS-pulver, 5 g sackaros (0,5 %) och 0,5 g MES-salter i dubbeldestillerat vatten. Justera volymen till 1 L, blanda och justera pH till 5.8 med KOH. Överför lösningen till en 1 L flaska och tillsätt 8 g växtagar (0,8 %). Autoklavera mediet.
- Förbered 1 l hårig rottillväxtmedium genom att blanda 4,4 g MS + B5 vitaminpulver, 30 g sackaros (3%) och 0,5 g MES-salter i dubbeldestillerat vatten. Justera volymen till 1 L, blanda och justera pH till 5.8 med KOH och överför lösningen till en 1 L flaska. Tillsätt 3 g geleringsmedel (0,3 %) och autoklavera mediet. Tillsätt cefotaxim och ticarcillindinatrium till en slutlig koncentration på 100-200 mg/l respektive 100-500 mg/l. Tillsätt vid behov lämplig antibiotika (resistens beror på T-DNA från en binär vektor).
- Förbered 1 l sammansatt växtmedium genom att blanda 2,2 g MS + B5 vitaminpulver, 10 g sackaros (1%) och 0,5 g MES-salter i dubbeldestillerat vatten. Justera volymen till 1 L, blanda och justera pH till 5.8 med KOH och överför lösningen till en 1 L flaska. Tillsätt 6 g geleringsmedel (0,6 %) och autoklavera mediet. Tillsätt cefotaxim och ticarcillindinatrium till en slutlig koncentration på 200 mg/l respektive 500 mg/l. Tillsätt vid behov lämplig antibiotika (resistens beror på T-DNA från en binär vektor).
- Förbered 1 l regenereringsmedium genom att blanda 4,4 g MS + B5 vitaminpulver, 30 g sackaros (3%) och 0,5 g MES-salter i dubbeldestillerat vatten. Justera volymen till 1 L, blanda och justera pH till 5.8 med KOH. Överför lösningen till en 1 L flaska och tillsätt 3 g geleringsmedel (0,3 %). Autoklavera mediet. Tillsätt NAA och BAP till en slutlig koncentration på 8 mg/L respektive 5 mg/L och ticarcillindinatrium till en slutlig koncentration på 100 mg/L.
- Förbered 1 l skottförlängningsmedium genom att blanda 4,4 g MS + B5 vitaminpulver, 20 g sackaros (2%) och 0,5 g MES-salter i dubbeldestillerat vatten. Justera volymen till 1 L, blanda och justera pH till 5.8 med KOH. Överför lösningen till en 1 L flaska och tillsätt 3 g växtagar (0,3%). Autoklavera mediet. Tillsätt BAP och GA3 till en slutlig koncentration på 0,5 mg/l respektive 0,03 mg/l och cefotaxim till en slutlig koncentration på 100 mg/l.
- Bered 1 l rotinduktionsmedium genom att blanda 2,2 g MS + B5 vitaminpulver, 10 g sackaros (1%) och 0,5 g MES-salter i dubbeldestillerat vatten. Justera volymen till 1 L, blanda och justera pH till 5.8 med KOH. Överför lösningen till en 1 L flaska och tillsätt 3 g geleringsmedel (0,3%). Autoklavera mediet. Tillsätt IBA och cefotaxim till en slutlig koncentration på 0,5 mg/l respektive 100 mg/l.
- Bered 1 l buffert av cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB) genom att tillsätta 20 g CTAB (2 % vikt/volym final), 100 ml 1M Tris-HCl, pH 8,0 (100 mM final), 40 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 (20 mM final), 81,8 g NaCl (1,4 M final) och 5 g PVP40 (0,5 % vikt/volym final). Justera till 1 L med dubbelt destillerat vatten. Autoklavera lösningen. Förvara lösningen i upp till 1 år i rumstemperatur.
2. Transformation av Agrobacterium med en binär vektor
- Förbered DNA från en verifierad binär plasmid som innehåller T-DNA-kassetten som ska integreras i växtgenomet. Se till att plasmid-DNA:t innehåller låga salter för att undvika elektriska gnistor när elektroporering används. Vi rekommenderar att du använder ett valfritt plasmid-DNA-extraktionskit.
- Bered elektrokompetenta Agrobacterium tumefaciens C58C1-celler som innehåller den hårrotsinducerande plasmiden pRiA4b genom inokulering av 200 ml förvärmd vätska (28 °C) YEB med 8 ml färsk odling över natten. Inkubera kulturen vid 28 °C under omskakning tills den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) är ca 0,5, vilket motsvarar mitten av logaritmningsfasen. Det tar ca 4 - 5 h.
- Dela upp Agrobacterium-kulturen i fyra förkylda sterila 50 ml centrifugrör. Centrifugera i 15 minuter vid 4 °C vid 3 200 x g.
OBS: Cellerna bör hållas kalla från detta steg och framåt. - Ta bort supernatanten och blanda försiktigt pelleten i (4x) 2,5 ml kall (4 °C) 10 % glycerol. Tillsätt ytterligare 47,5 ml kall 10 % glycerol och blanda försiktigt.
- Pelletceller vid 3 200 x g i 15 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i (4 x) 10 ml kall 10 % glycerol.
- Pelletera cellerna igen och återsuspendera dem i (4x) 0,75 ml kall 10% glycerol. Slå samman innehållet i alla fyra rören till ett (total volym = 3 ml).
- Dela upp den agrobakteriella lösningen i 50 μl alikvoter i förkylda sterila 1,5 ml mikrorör. Frys in alikvoter på torris eller flytande kväve. Förvara rören vid -80 °C för framtida bruk.
- Placera ett rör med kompetenta celler (50 μL) på is, blanda med 5 μL plasmid-DNA (totalt 1 μg, från steg 2.1), överför blandningen till en elektroporationskyvett (0,2 cm mellanrum) och inkubera i 5 minuter på is.
- Placera kyvetten i elektroporatorn och elektroperera cellerna med följande inställningar: kapacitans 25 μFD, resistans 400 Ω, elektrisk spänning 2,5 kV, pulslängd 9,7 ms.
- Tillsätt 950 μL LB flytande medium till cellerna, som sedan odlas vid 28 °C i 2 timmar vid 300 rpm i en termomixer. Platta 50 μl av cellkulturen på ett fast LB-medium med lämpligt selektivt antibiotikum. Odla plattorna i 2 dagar vid 28 °C.
OBS: Det rekommenderas att plätera en rad cellkulturer (10 μL - 100 μL) per platta för att bestämma en korrekt odlingsvolym och undvika överväxt av bakterier. - Bered flytande kulturer från några utvalda kolonier i 5 ml LB flytande medium med antibiotika. Odla bakterierna över natten vid 28 °C genom att skaka. Använd dessa kulturer för glycerollager genom att blanda 0,5 ml flytande bakteriekultur och 0,5 ml 40 % glycerol.
OBS: Dessa kolonier verifieras för förekomst av transgenen med koloni-PCR. För detta ändamål, tillsätt en liten mängd av en koloni från en platta till PCR-masterblandningen som innehåller buffert, dNTP och Taq-polymeras efter val, tillsammans med primers som amplifierar en del av T-DNA från en binär vektor. Inokulat från glycerollagren används för omvandling av växterna.
3. Hårig rotomvandling av Brassica napus DH12075
- Placera frön av Brassica napus DH12075 i mikrorör och sterilisera dem i en flödeslåda. Avfetta först fröna med vatten och 0,1 % tvättmedel medan du skakar i 60 s. Skölj sedan fröna med vatten följt av 70 % etanol, båda i 60 s.
- Sterilisera fröna med en 10% lösning av kommersiellt blekmedel som innehåller natriumhypoklorit. Skaka fröna i denna lösning i 20 minuter.
- Tvätta fröna 4 gånger med sterilt vatten i 60 s vardera. Lägg dem på petriskålar som innehåller frögroningsmediet. Kallskikta fröna vid 4 °C över natten och flytta plattorna till ett odlingsrum (21 °C, 16 timmar ljust/8 timmar mörkt).
- Överför 5 dagar gamla plantor till växtodlingslådor som innehåller ett växtodlingsmedium.
OBS: Den bästa omvandlingseffektiviteten i DH12075 identifierades för 18 dagar gamla plantor. Plantans ålder kan optimeras för de lokala tillväxtförhållandena eller andra sorter. - Inokulera en flytande kultur av Agrobacterium tumefaciens C58C1 som bär en hårig rotinducerande plasmid pRiA4b och den binära vektorn för transformation (från steg 2.11) med en inokuleringsslinga. Använd 5 ml LB medium. Odla denna gröda över natten vid 28 °C tills den når OD600 = 0,9 - 1.
OBS: Agrobacterium som endast innehåller Ri-plasmiden används om håriga rötter av vildtyp produceras. - Injicera en liten mängd kultur (cirka 50 μL) med en insulinspruta i hypokotylen på en 18 dagar gammal planta (från steg 3.4). Stick hål på hypokotylen med en 26G-nål monterad på sprutan ca 1 cm ovanför mediets yta. Injicera vätskan i såret. Vävnaden på hypokotylens yta kan också repas av sprutan.
OBS: Antalet inokulerade plantor måste anpassas till försöksledarens behov. - Sätt tillbaka plantorna i odlingsrummet vid 21 °C i 2 till 4 veckor tills en förhårdnad och håriga rötter bildas på sårstället.
- Skär av förhårdnaden med de uppkomna håriga rötterna från hypokotylen och placera den på en petriskål med det håriga rottillväxtmediet som innehåller selektiva antibiotika (som bärs av T-DNA) och cefotaxim (200 mg/L) och ticarcillin (500 mg/L) för att undertrycka agrobakteriell tillväxt. Försegla petriskålarna med gasgenomsläpplig tejp. Odla de håriga rötterna vid 24 °C i mörker.
OBS: Korrekt koncentration av specifika antibiotika som används för funktionellt urval måste testas med håriga rötter av vildtyp. För B. napus DH12075 håriga rötter som är resistenta mot kanamycin används en koncentration på 25 mg/L kanamycin.
OBS: I detta steg är det möjligt att generera en sammansatt växt som består av vildtypsskott och transgena håriga rötter som stöder tillväxten av en sådan växt. Istället för att skära av de håriga rötterna från en stam tar man bort växtens ursprungliga rötter. Växten med framväxande håriga rötter överförs till en växtodlingslåda med ett sammansatt växtodlingsmedium som innehåller cefotaxim (200 mg/L) och ticarcillin (500 mg/L) för att undertrycka agrobakteriell tillväxt och det selektiva antibiotikumet (som bärs av T-DNA). - Efter 1-2 veckor isolerar du de håriga rötterna på petriskålen från förhårdnaden och individualiserar dem på tallrikar med samma odlingsmedium. Överför kulturen till en ny tallrik var 4:e till 5:e vecka. Tillsätt 0,25 mg/l IBA för att öka rotförgreningen.
- Minska koncentrationerna av cefotaxim och tikarcillin gradvis med 100 mg/l vid varje överföring (dvs. mediet för den första överföringen innehåller 100 mg/l cefotaxim och 400 mg/l tikarcillin; för den andra överföringen 300 mg/l tikarcillin osv.). Efter 3-4 månader odlas de håriga rötterna på ett odlingsmedium med 100 mg/L tikarcillin och det selektiva antibiotikumet.
4. Regenerering av Brassica napus DH12075 håriga rötter
- Överför oberoende håriga rotlinjer till plattor med regenereringsmedium under sterila förhållanden med hjälp av en pincett, flammad före användning. Överför 5 - 10 rötter per petriskål och odla dem vid 21 °C under en lång dags fotoperiod (16 timmar ljust / 8 timmar mörkt). Försegla petriskålarna med gasgenomsläpplig tejp.
- Var 3:e till 4:e vecka, överför de håriga rötterna till plattor med färskt regenereringsmedium. Observera att calli bildas efter cirka 2 veckor. Förhårdnaden börjar skjuta efter ytterligare 2 veckor till 8 - 9 veckor efter att förhårdnaden bildats.
- Individualisera skotten och överför dem till växtodlingslådor med skottförlängningsmedium i 2 till 3 veckor för att främja förlängningen av skotten.
- Överför de långsträckta skotten till växtodlingslådor med ett rotinduktionsmedium. Uppdatera kulturen var 3:e - 4:e vecka. Rotningseffektiviteten i DH12075 är 87 % efter 30 dagar och upp till 100 % efter 60 dagar.
- Överför de rotade växterna till jorden efter att ha tagit bort alla spår av geleringsmedel för att förhindra svampinfektion. Se till att växterna först acklimatiseras i fytotronerna (21 °C, fotoperiod under långa dagar, 150 μE) och överför dem sedan till ett växthus för blomning (21 °C / 18 °C, fotoperiod för långa dagar, 150 μE).
5. Val av regenerant och T1-växt
OBS: De håriga rotlinjerna kan väljas innan du går in i regenereringsprocessen. Typen av selektion beror på det innehåll som transgenen bär. De håriga rötterna kan provtas för DNA-extraktion och genotypning eller mutationsdetektion, RNA-extraktion med efterföljande cDNA-syntes och RT-qPCR för expressionsnivåanalys av den valda genen, mikroskopi för fluorescensdetektion eller behandlas för GUS-färgning.
- Efter överföring till jord genotypas de T0-regenererande växterna (och T1-plantorna) igen för att undvika att de undgår urvalsförfarandena. T0-växter uppvisar en förändrad fenotyp som kallas Ri-fenotyp: omfattande rottillväxt, lockiga blad och dvärgskott orsakade av närvaron av TL och/eller TR-DNA från Ri-plasmiden som förs in i växtgenomet.
- För att påskynda T1-selektionen, använd frön som innehåller gröna mogna embryon (ca 21 - 28 dagar efter pollinering för DH12075 för ett torpedembryo eller äldre) från T0-regeneranta växter för embryoräddning.
- Arbeta i den sterila flödesboxen. Samla upp siliques och ytsterilisera dem med 70 % etanol.
- Placera dem på en dubbelhäftande tejp som tejpas på ett tallrikslock eller en rutschkana.
- Använd en stereokikare och skär silikan längs klaffkanterna med en 26G-nål. Se till att snittet inte skadar fröna. För enkelt grepp, montera nålen på en 1 ml spruta.
- Öppna fruktbladen och fäst dem på tejpen. Samla de omogna fröna och överför dem till plattor med medium för frögroning. Försegla plattorna med gasgenomsläpplig tejp.
- Placera plattorna i ett odlingsrum (21 °C, 16 h ljust/8 h mörkt) tills de gror.
- Genotypa T1-plantorna med avseende på förekomst av den aktuella transgenen och frånvaro av Ri TR/TL (figur 1). Samla bladmaterial och extrahera deras DNA med hjälp av den valda metoden. CTAB-metoden beskrivs här:
- Samla bladmaterialet i ett 2 ml mikrorör som innehåller två keramiska pärlor. Frys röret i flytande kväve.
- Slipa materialet med en kulkvarn. Alternativt kan mortelstöt och mortel användas.
- Efter en snabb nedrullning tillsätts 400 μL CTAB-buffert till pulvret. Virvla kort, snurra ner och inkubera vid 60 °C i minst 50 minuter.
- Kyl lösningen till rumstemperatur i 15 min. Tillsätt en del kloroform och blanda försiktigt.
VARNING: När du använder kloroform, arbeta under kemikalieflödet och använd handskar för skydd. Alla lösningar som innehåller kloroform ska kasseras i lämplig soptunna. - Centrifugera i 5 minuter vid 18 400 x g med en bordscentrifug. Överför 250 - 350 μL av den övre vattenfasen till ett nytt mikrorör. Utelämna interfasen.
- Tillsätt en volym isopropanol, blanda väl och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur. Centrifugera i 40 minuter vid 18 400 x g.
- Kassera vätskan och tillsätt 200 μl 70 % etanol. Tvätta pelleten och centrifugera i 15 minuter vid 18 400 x g.
- Kassera vätskan. Lufttorka pelleten och tillsätt 50 - 100 μL ultrarent vatten. Låt DNA:t lösas upp i 1 timme till över natten i kylen.
- Utför en genotypning med PCR för rolA-genen (TL), aux1-genen (TR) och virC-lokus (Agrobacterium). Bered PCR-reaktionen med hjälp av det beredda DNA:t (från steg 5.3.), primers, buffert, dNTP och Taq-polymeras enligt tillverkarens protokoll. De förstärkta fragmenten är 200 - 500 bp långa.
Primers som är specifika för rolA:
Framåt: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAG
Baksida: TGCGTATTAATCCCGTAGGTC
Primers som är specifika för aux1:
Framåt: CATAGGATCGCCTCACAGGT
Baksida: CGTTGCTTGATGTCAGGAGA
Primers som är specifika för virC:
Framåt: AATGCGTCTCTCTCGTGCAT
Baksida: AAACCGACCACTAACGCGAT
ANMÄRKNING: ÖVERFÖRING OCH INTEGRATION AV T-DNA kan vara partiell, och endast delar av TL och/eller TR kan integreras i genomet. Därför rekommenderas det att analysera förekomsten av andra ORF av TL (t.ex. rolB och rolC) och TR (aux2, mas1, ags1) i T1-plantor. Primersekvenser som är specifika för dessa loci listas i Jedličková et al.9. - Utvärdera PCR-reaktioner med gelelektrofores.
OBS: Att inkludera en positiv kontroll i denna analys rekommenderas för att säkerställa att ha PCR-klassat DNA. - Välj för närvaron (eller frånvaron) av transgenen enligt protokollen baserade på innehållet i denna transgen.
- Överför valda plantor till jorden.
6. Hårig rotomvandling och regenerering i Arabidopsis thaliana Col-0
- Ytsterilisera A. thaliana-frön med valfri metod (blekmedel, etanol eller klorgas).
- Platta sterila frön på ett medium för frögroning. Efter 2 dagars kall skiktning, flytta plattorna till ett odlingsrum (21 °C med lång fotoperiod och 50 % luftfuktighet).
- Överför 1 vecka gamla plantor till en växtodlingslåda med växttillväxtmedium.
- Bered Agrobacterium-kulturer enligt anvisningarna i steg 3.5.
- Injicera en liten mängd kultur (cirka 50 μL) med en nål monterad på en insulinspruta vid basen av den primära blomställningstjälken (cirka 1 - 2 cm ovanför rosetten) på 1 månad gamla Arabidopsis-plantor . Vävnaden på ytan av primärstammen kan också repas av sprutan.
- Vid 2-4 veckor efter injektionen, ta bort de framväxande håriga rötterna och odla dem på petriskålar med det håriga rottillväxtmediet kompletterat med det selektiva antibiotikumet (som bärs av T-DNA) och cefotaxim (200 mg/L) och ticarcillin (500 mg/L) för att undertrycka agrobakteriell tillväxt. Inkubera plattorna vid 24 °C i mörker.
- Efter 1-2 veckor individualiserar du de håriga rötterna på plattor med samma odlingsmedium. Överför de valda håriga rotlinjerna till ett färskt medium var 4:e - 5:e vecka.
OBS: A. thaliana håriga rötter är tunnare än de hos B. napus, och försiktighet måste iakttas vid överföring till färska medier. - Överför de håriga rötterna till plattor med regenereringsmedium för att inducera förhårdnadsbildning. Odla plattorna vid 21 °C under en lång dags fotoperiod (16 timmar ljust / 8 timmar mörkt).
- Skott kommer ut från förhårdnaden efter 18 - 21 dagars odling. Klipp av skotten och överför dem till ett skottförlängningsmedium i 2-3 veckor för att främja tillväxt och förlängning.
- Överför de långsträckta skotten till rotinduktionsmediet.
- Överför de rotade växterna till jorden. T0-växter uppvisar också en Ri-fenotyp. Utför det transgena urvalet, enligt beskrivningen för B. napus DH12075 (steg 5).
Representative Results
Vi har tidigare optimerat ett protokoll för injektionsbaserad induktion av hårrot i tre sorter av Brassica napus, nämligen DH12075, Topas DH4079 och Westar9. För att tillämpa detta transformationsprotokoll på modellarten A. thaliana injicerades de primära blomställningsstjälkarna på 1 månad gamla plantor med ett agrobakteriellt inokulum. Håriga rötter dök upp vid injektionsstället efter 2-4 veckor. Håriga rötter skars ut och odlades på det fasta mediet. Jämförelsen av metoden hos dessa två arter visas i figur 1.
Utvalda håriga rotlinjer överfördes till regenereringsmediet för att inducera skottbildning. Hos A. thaliana inducerades gula calli inom 14 dagar i alla 10 testade håriga rotlinjer. Första skottet är synligt som mörkgröna fläckar inom 3 veckor efter överföring till regenereringsmediet (Figur 2). Efter 4 veckors odling täckte skotten de håriga rötterna i 9 av 10 håriga rotlinjer (90 % regenereringseffektivitet). I vissa fall framkallades adventivrötter från förhårdnaden (Figur 2H). En linje regenererades inte ens efter 3 månader på regenereringsmediet (var 4:e vecka överfördes de håriga rötterna till ett nytt medium). Således liknar regenereringseffektiviteten hos A. thaliana håriga rötter effektiviteten hos B. napus DH120759.
Håriga rotregeneranter av B. napus och A. thaliana uppvisar en dvärgfenotyp (figur 3), ett typiskt kännetecken för de håriga rotväxterna2. Vi observerade också täta rotsystem, skrynkliga blad och förändringar i blomningstiden. Denna så kallade hårrotsfenotyp (eller Ri) orsakas av rol-generna från Ri-plasmiden som sätts in i växtgenomet. Införandet av Ri T-DNA och den transgen som kodas på en binär vektor kan vara oberoende eller kopplade. En segregeringsanalys av T1-avkommor som skapats genom självpollinering hjälper till att identifiera rollfria plantor som uttrycker den transgen som är av intresse. Genotypning av T1-växterna utförs med PCR-primrar som är specifika för ORF:erna av TL och TR och den transgen som är av intresse. Frånvaron av agrobakteriell kontaminering verifieras genom frånvaron av PCR-produkter från virC-primrar (figur 1).
Figur 1: Sammanfattning av proceduren hos A. thaliana och B. napus. Injektionen av Agrobacterium inoculum i hypokotylstammen eller den primära blomställningsstammen inducerar utvecklingen av håriga rötter. De håriga rötterna kan ersätta de inhemska rötterna för att generera en sammansatt växt som kommer att genotypas och analyseras (blå pilar). Odlade håriga rötter kan regenereras till T0-plantor, förökas i T1-plantor och genotypas (gröna pilar). De håriga rötterna kan också subodlas för funktionell analys (svart pil). Exempel på genotypningsresultat presenteras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Regenerering av håriga rötter hos A. thaliana. (A) Hårig rotkultur 1 dag efter dess överföring till plattor. (B, C) Calli utvecklades inom 2 veckor efter odling på regenereringsmedium. (D, E) Shoot primordia dök upp efter 3 veckors odling. (G, H) Skott bildas efter 4 veckor. H) Adventivrötter som utvecklats från förhårdnaden. (C, F, I) Icke-regenererande hårig rotlinje. Skalstrecken representerar 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa foton av vildtypsväxter av B. napus och A. thaliana och regeneranter från hårrötter (T0-växter). Notera Ri-fenotypen för regeneranterna. Skalstrecken representerar 2 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Vi utvecklade ett enkelt protokoll för omvandling av håriga rötter och efterföljande regenerering i B. napus och A. thaliana. Denna process inkluderar injektionsbaserad induktion av hårig rot i hypokotylstammen (B. napus) eller den primära blomställningsstammen (A. thaliana). Metoden att injicera hypokotylen med agrobakteriell stam C58C1 som bär på en Ri-plasmid var också effektiv i Fabaceae-familjen10,11, förutom de medlemmar av Brassicaceae som presenterades i denna studie.
Ett alternativ till den injektionsbaserade metoden är den immersionsbaserade omvandlingen som består av nedsänkning i en bakteriell suspension, följt av samodling av explanten med agrobakterier. Fördelen med den injektionsbaserade metoden jämfört med nedsänkningsmetoden är den tid som sparas genom frånvaron av några protokollsteg: explantationsberedning, ett test av samodlingstiden och odling på ett medium som innehåller hormon för induktion av håriga rötter. Även om båda metoderna är effektiva för induktion av håriga rötter, observerades högre omvandlingseffektivitet hos vissa arter med den injektionsbaserade metoden jämfört med explantationsnedsänkningen en12,13. Dessutom är injektionsbaserad omvandling också användbar för att generera sammansatta växter (transgena håriga rötter och skott av vildtyp). Efter att ha skurit av de ursprungliga rötterna på den transformerade växten stöder håriga rötter växtens tillväxt, och transgenen kan studeras i samband med hela växten.
Det kritiska steget för induktion av hårig rot är att injicera inokulatet i hypokotylen, eller den primära blomställningsstammen. Hypokotylerna hos B. napus är brytbara, och det kan lätt hända att hela hypokotylen skärs av. Samma sak kan observeras med A. thaliana på grund av blomställningens tunna stjälk. Om en jämförelse av omvandlingseffektiviteten för olika arter/sorter krävs, rekommenderar vi att en person utför alla experiment för att undvika fel som orsakas av manipulation och skicklighet i att injicera växterna.
Vi utvecklade ett effektivt protokoll för regenerering av håriga rötter i B. napus DH12075 och A. thaliana Col-0. Eftersom regenerering är en mycket varierande process kan vissa protokolländringar tillämpas på en valfri art eller sort. Till exempel kan de håriga rothärledda skotten framkallas av ett annat auxin/cytokinin-förhållande (1:1) i B. oleracea14. Alternativt kan cytokinintidiazuron användas i stället för BAP, som i fallet med B. campestris håriga rötter15.
Flera insättningar av Ri-plasmiden T-DNA i växtgenomet representerar en potentiell begränsning av det håriga rotomvandlings- och regenereringssystemet. I sådana fall upptäcks inga plantor som är fria från TL/TR från Ri-plasmiden efter en seghetsanalys av T1-plantor. Därför rekommenderar vi att du genererar flera oberoende håriga rotlinjer för varje transgen.
Håriga rotkulturer är ett extremt kraftfullt verktyg för genfunktionsstudier, främst på grund av deras snabba etablering och billiga underhåll (inga hormoner behövs i odlingsmedier). Detta protokoll täcker metoderna för induktion och regenerering av håriga rötter i B. napus och A. thaliana, som kan användas för att studera den transgen av intresse direkt i håriga rotkulturer, i samband med hela växten med hjälp av sammansatta växter, eller efter regenerering av de transgena växterna.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen genomfördes utan några kommersiella eller ekonomiska relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar Jiří Macas (Biology Centre CAS, České Budějovice, Tjeckien) för att ha tillhandahållit den agrobakteriella stammen. Core Facility Plants Sciences vid CEITEC MU är erkänd för sitt tekniska stöd. Detta arbete stöddes av Tjeckiens ministerium för utbildning, ungdom och idrott med Europeiska regionala utvecklingsfonden-projektet "SINGING PLANT" (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) och INTER-COST-projektet LTC20004.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.50 mL tubes | Eppendorf | 125.215 | |
| 10% solution of commercial bleach | SAVO | ||
| 1-naphthaleneacetic acid (NAA) | Duchefa | N0903 | Callus regeneration medium |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 108.132/108.078 | |
| 3M micropore tape | Micropore | ||
| 6-Benzylaminopurine (BAP) | Duchefa | B0904 | Callus regeneration medium, Shoot elongation medium |
| 70% ethanol | |||
| bacteriological agar | HiMedia | RM201 | LB medium |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | LB and YEB media |
| Beef extract | Roth | X975.1 | YEB medium |
| Bottles | DURAN | L300025 | |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
| chloroform | Serva | 3955301 | |
| CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide | Sigma | 52365 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | R0193 | |
| EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma | ES134-250G | |
| elctroporation cuvette | |||
| electrophesis agar, peqGOLD universal | VWR | 732-2789 | |
| electrophoresis chamber | BIO-RAD | ||
| electrophoresis gel reader | BIO-RAD | ||
| electroporator GenePulser Xcell | BIO-RAD | ||
| ethidium bromide | AppliChem | ||
| Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap | BIO-RAD | 1652082 | |
| Gene Ruler DNA ladder mix | Thermo Fisher Scientific | SM0331 | |
| Gibberellic acid (GA3) | Duchefa | G0907 | Shoot elongation medium |
| glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique | Merck | 1101100250 | |
| indole-3-butyric acid (IBA) | Duchefa | I0902 | Root induction medium |
| kanamycin monosulfate | Duchefa | K0126 | |
| Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid | Plant Media | V8505-100 | |
| Measuring cylinder | |||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
| Murashige and Skoog medium (MS) | Duchefa | M0237 | Medium for germination, Plant growing medium |
| Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins | Duchefa | M0231 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
| needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm | Terumo | ||
| pH meter | |||
| Phytagel | Sigma | P8169 | Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination |
| PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000) | Sigma | 9003-39-8 | |
| Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included | Sigma | D4309-250UN | |
| Retsh mill | Qiagen | ||
| sodium chloride | Lachner | 30093-APO | LB medium |
| square Petri Dishes | Corning | GOSSBP124-05 | |
| sucrose | Penta | 24970-31000 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
| Syringe filter | Carl Roth | P666.1 | Rotylabo syringe filters 0.22 µm pore size |
| thermomixer | Eppendorf | ||
| Ticarcillin disodium | Duchefa | T0180 | Hairy root growing medium |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethan | Serva | 3719003 | |
| ultrapure water | Millipore Milli-Q purified water | ||
| Yeast extract | Duchefa | Y1333 | LB medium |
References
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Christey, M. C. Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures—a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean. Plants. 11 (8), 1044 (2022).
- Petit, A., et al. Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation. Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).
- Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops. Crop improvement. , Springer. Boston, MA. (2013).
- Jedličková, V., et al. Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus). Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).
- Steinbauerová, V., Neumann, P., Macas, J. Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).
- Neumann, P., et al. Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species. Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).
- Montazeri, M., et al. A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum. Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).
- Zhang, X., et al. Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response. Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).
- Christey, M. C., Sinclair, B. K. Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation. Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).
- Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation. Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).
