Summary
本方案描述了一种在用2i和LIF培养基培养过程中对小鼠胚胎干细胞进行反向多转染的方法。与传统的正向转染方案相比，该方法具有更高的活力和效率，同时还能够实现质粒比率的一锅优化。
Abstract
由于其相对简单和易用性，用核酸瞬时转染哺乳动物细胞系已成为生物医学研究的支柱。虽然大多数广泛使用的细胞系在贴壁二维培养物中具有可靠的转染方案，但这些方案通常不能很好地转化为研究较少的细胞系或具有非典型、难以转染形态的细胞系。该方法使用在2i/LIF培养基中生长的小鼠多能干细胞（一种广泛用于再生医学的培养模型），概述了一种优化的快速逆转录转染方案，能够实现更高的转染效率。利用该方案，进行三质粒多转染，利用质粒递送中高于正常效率的效率来研究范围更广的质粒化学计量。这种反向多转染方案允许采用一锅实验方法，使用户能够在单个孔中优化质粒比率，而不是在多个共转染中优化质粒比率。通过促进快速探索DNA化学计量对递送遗传回路整体功能的影响，该协议最大限度地减少了胚胎干细胞转染的时间和成本。
Introduction
将 DNA 和 RNA 递送至哺乳动物细胞是生物医学研究的核心支柱1.将外源核酸 （NA） 引入哺乳动物细胞的常用方法是瞬时转染 2,3。该技术依赖于将 NA 与能够将其递送至受体细胞的市售转染试剂混合。通常，NA 通过正向转染递送，其中粘附在二维表面的细胞接受转染复合物。虽然对最常见的已建立细胞系进行正向转染是稳健的，并且实验方案已广泛发表，但更多具有非单层形态的利基细胞类型不容易转染，从而限制了可递送的 NA 量和接收它的细胞数量。
多能干细胞 （PSC） 是理解发育的有吸引力的模型，也是再生医学的工具，因为它们能够无限分裂并产生任何身体细胞类型。对于小鼠 PSC （mPSC），具有 2 种抑制剂和 LIF （2i/LIF） 的常规体外培养条件保持圆顶状集落形态，直接限制暴露于正向转染的细胞数量 4,5,6。为了解决这个问题，可以进行反向转染：将细胞加入含有培养基和转染试剂的培养皿中，而不是将转染试剂添加到贴壁细胞中 7。虽然这增加了暴露于试剂的细胞数量，但也需要同时传代和转染细胞。
除了简单的单NA转染之外，研究人员通常还致力于在体外将几种NA构建体递送至细胞群中。这通常通过共转染实现，其中 NA 以给定比例（1：1、9：1 等）混合，然后与所选转染试剂结合 8。这会产生 NA 和试剂的混合物，该混合物保留了 NA 彼此之间的原始比例 - 虽然处理中的细胞可能接受不同量的这种混合物，但它们都接受相同的比例9。虽然当知道所需的零件比例时，这是有利的，但提前确定该比例可能是劳动密集型的，每个比率都构成不同的条件。一种替代方法是进行“多转染”，即将单个 NA 与转染试剂彼此独立地混合9。通过组合含有单个 NA 的转染复合物（而不是在创建复合物之前组合 NA），研究人员可以在单次转染实验中探索各种 NA 化学计量学9。这在预计多个 NA 的产物会相互作用的情况下特别有价值，例如与诱导型转录系统或具有内置反馈的系统 1,10,11。然而，要有效地做到这一点，需要高转染效率。事实上，随着独特转染 NA 数量的增加，给定细胞接收所有所需 NA 的概率呈指数下降 9,12。
以下报告描述了使用基于阳离子脂质的转染试剂的 mPSC 反向转染方案，其中细胞暴露于试剂-NA 混合物中最多 5 分钟，以最大限度地提高活力并最大限度地减少典型培养条件之外的时间。将该方案与这些细胞的标准正向转染进行比较，显示出更高的转染效率和存活转染细胞总数的增加。通过将这种反向转染与涉及简单荧光报告基因的三质粒多转染相结合，证明了以高转染效率筛选 NA 比率的扩展潜力。
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Protocol
1. mPSC培养试剂的制备
- 准备 N2 补充剂。
- 在非无菌条件下，在化学安全通风橱中制备以下储备溶液（步骤1.1.1.1）。将每种化学品的固体粉末加入预先称量的 50 mL 锥形管中。加入粉末后称量每管，加入适量溶剂，达到以下浓度。对于一批培养基，请准备列出的最小量。
注意：以下试剂是危险的，应按照当地的化学品安全指南进行处理。处理时确保适当的个人防护装备，并且仅在化学通风橱中使用这些化学品的固体粉末形式，以防止吸入。- 0.05 mL 亚硒酸钠在 0.518 mg/mL 的水溶液中，0.5 mL 腐胺在 160 mg/mL 的水溶液中，0.165 mL 黄体酮在 0.6 mg/mL 的 100% 乙醇溶液中（见 材料表）。
- 将溶液储存在-20°C长达2年。
- 在生物安全柜 （BSC） 中，将以下内容添加到 58.035 mL DMEM-F12 中。
- 0.05 mL 0.518 mg/mL 亚硒酸钠溶液、0.5 mL 160 mg/mL 腐胺溶液、0.165 mL 0.6 mg/mL 黄体酮溶液。
- 过滤器 用 0.22 μm 过滤器对上述混合物进行灭菌。
- 仍在 BSC 中，制备 100 mg/mL 脱脂转铁蛋白溶液。
- 将 5 mL DMEM-F12 加入 500 mg 载脂转铁蛋白（参见 材料表）。慢慢重新悬浮并清洗容器，避免气泡。
- 用 5 mL 重悬并尽可能多地去除后，将其添加到亚硒酸盐/腐胺/黄体酮溶液中。取更多以前的溶液并清洗脱脂蛋白瓶，尽可能多地取出。
- 向溶液中加入 5 mL 7.5% BSA 馏分 V（参见 材料表）。
- 每管混合并等分 6.875 mL。将等分试样储存在-80°C长达1年。
- 使用上述 N2 等分试样制备 N2B27 培养基时，解冻所需的等分试样，并向 6.875 N2 中加入 3.125 mL 4 mg/mL 胰岛素溶液（参见 材料表），以获得 10 mL 100x N2。
- 在非无菌条件下，在化学安全通风橱中制备以下储备溶液（步骤1.1.1.1）。将每种化学品的固体粉末加入预先称量的 50 mL 锥形管中。加入粉末后称量每管，加入适量溶剂，达到以下浓度。对于一批培养基，请准备列出的最小量。
- 准备 N2B27 基础培养基。
- 将 N2 和 B27 补充剂在 4 °C 冰箱中解冻数小时或过夜。
- 在 BSC 中，将 484.5 mL 的 DMEM-F12 和 484.5 mL 的 Neurobasal 培养基（参见 材料表）混合在无菌的 1 L 瓶中。
- 向培养基中加入 10 mL B27 和 10 mL N2 添加剂。
- 加入 1 mL 55 mM β-巯基乙醇（参见 材料表）。加入 10 mL 100x 谷氨酰胺。通过旋转瓶子剧烈混合。
- 每等分试样（通常为100mL）等分所需体积，并在-80°C下储存长达1年。在4°C下解冻后储存使用长达3周。
- 准备 NBiL 介质。
- 在 4 °C 冰箱中从 -80 °C 解冻 100 mL 等分试样的 N2B27 基础培养基。
- 在平衡计分卡中，将 LIF（参见 材料表）添加到 10 μg/L 的终浓度。
- 加入CHIR99021（3μM最终）和PD0325901（1μM最终）（参见 材料表）。用 50 mL 血清移液管充分混合。在4°C下储存长达2周。
- 制备0.2%明胶溶液。
- 将 500 mL 双蒸馏 H2O 转移到 1 L 玻璃瓶中。
- 量出 1 克明胶（见 材料表）并将其加入水中。摇晃瓶子混合，直到大部分溶解。
- 将明胶和水混合物在15psi，121°C下高压灭菌35分钟。冷却后，在 BSC 中用 0.22 μm 过滤器对其进行过滤灭菌。储存在4°C。
- 准备洗涤介质。
- 在 BSC 中，每 10 mL DMEM-F12 混合 160 μL 7.5% BSA。
- 扩大上述规模并大量制备，以便将来使用（例如，8 mL 7.5% BSA 至 500 mL DMEM-F12）。储存在4°C。
2. mPSC多转染试剂的制备
注意：为 24 孔板的单个孔提供了以下值。可以相应地缩放值。所有DNA/质粒的序列详见 补充文件1。
- 计算每次治疗所需的DNA溶液体积。
- 每个孔/条件制备 500 ng DNA。
- 如果用 100 ng/μL 的 DNA 溶液转染单个质粒，则用 5 μL DNA 制备一个试管。
- 如果以100 ng/μL的速率转染两个质粒，则准备两个试管，每个试管中含有2.5μL，每个质粒一个。
- 每个孔/条件制备 500 ng DNA。
- 在 BSC 中，执行以下操作：对于每 500 ng 转染处理（参见 材料表），将 25 μL OptiMEM 等分试样放入 1.5 mL 试管中。
- 相应地缩放 - 在上面的示例中，准备两个试管，每个试管含有 250 ng DNA （2.5 μL） 和 12.5 μL OptiMEM。
- 将该治疗所需的 DNA 体积添加到试管中的 OptiMEM 中。
- 对于每个含有 500 ng DNA 和 OptiMEM 的试管，使用另外 25 μL OptiMEM 和 1 μL 阳离子脂质转染试剂创建一个匹配的试管。
- 同样，必须相应地缩放这些值。对于上述示例，准备两个试管，每个试管含有 12.5 μL OptiMEM 和 0.5 μL 转染试剂。
注意：缩放值时，请使用添加的 DNA 质量，而不是该数量的 DNA 所需的体积。转染试剂和 DNA 的反应可以按比例缩放（例如，如果要用相同的 DNA 转染 5 个孔）。保持试剂的比例相同，但相应地缩放（例如，1000 ng DNA：50 μL OptiMEM：2 μL 转染试剂：50 μL OptiMEM）。
- 同样，必须相应地缩放这些值。对于上述示例，准备两个试管，每个试管含有 12.5 μL OptiMEM 和 0.5 μL 转染试剂。
3. 用于转染的mPSCs的制备
注意：对于反向转染，在添加转染试剂之前，准备培养容器并直接传代 mPSC。对于正向转染，在转染前 12-18 小时传代并铺板细胞，以使细胞粘附在平板上。
- 准备0.2%明胶包被的细胞培养容器。
- 计划转染所需的孔数（每个处理/组一个 24 孔板的孔数）。
- 将 200 μL 0.2% 明胶溶液加入 24 孔板中的每个所需孔中。
- 轻轻摇晃板以均匀散布溶液，确保它覆盖整个井底。
- 让孔在室温下涂覆至少15分钟。
- 使用真空吸气器，小心地从孔中去除任何剩余的明胶（倾斜板以确保去除所有液体而不会刮掉明胶层）。
- 向每个孔中加入 0.5 mL NBiL 培养基（步骤 1.3），并将板留在组织培养箱中预热。
- 传代 mPSC。
- 将 30 mL 洗涤介质（步骤 1.5）等分装到 50 mL 锥形管中。
- 从mESC的组织培养皿中吸出旧培养基。
注意：允许使用多种抽吸技术。无论选择哪种技术，都要确保细胞不会长时间保持干燥（最多约 30 秒）。 - 加入所需量的市售细胞分离培养基（10 cm 培养皿为 1.5 mL，相应缩放，参见 材料表）。
- 等待3-5分钟，然后用P1000移液器上下移液15-20次，以获得单细胞悬浮液。在显微镜下观察细胞，以确保单细胞悬浮液。
- 将分离培养基中的细胞转移到含有洗涤培养基的 50 mL 试管中。
- 在室温下以300× g 离心5分钟。吸出洗涤介质，确保试管中没有残留液体。
- 将沉淀重悬于少量洗涤介质（~300μL）中。使用血细胞计数器计数细胞悬液以获得细胞密度。
4. mPSCs的反向转染
- 根据步骤2制备多转染试剂。
- 根据步骤 3 制备细胞培养容器和传代 mPSC。
- 将 200 μL NBiL 培养基等分到 1.5 mL 试管中，每次处理一个。
- 向 DNA：OptiMEM 混合物中加入 26 μL OptiMEM：转染试剂混合物。通过移液约10次快速而剧烈地混合试剂。让混合物在室温下孵育5分钟。
- 根据细胞密度，将所需体积的细胞从 300 μL 细胞悬液转移到 200 μL NBiL 管中，以获得每管 25,000 个细胞。
- 将 Lipofectamine 2000（L2K，转染试剂）和 DNA 混合物孵育 5 分钟后，将其加入 1.5 mL 细胞管中，并通过移液充分混合。让细胞在室温下与试剂一起孵育5分钟。
- 在室温下以300× g 离心5分钟。移出液体，剩下约 50 μL。
- 用 100 μL NBiL 培养基重悬细胞沉淀。将细胞转移到培养皿中并将培养箱中放置。24 小时后使用新鲜的 NBiL 培养基更换培养基。
5. mPSCs的正向转染
- 转染前12-18小时，根据步骤3制备细胞培养容器和传代mPSC。
- 根据细胞密度，将所需体积的细胞从 300 μL 细胞混合物中转移到每孔接种 25,000 个细胞。将培养板放入培养箱中。
- 转染前 1 小时，从所有孔中抽吸培养基并用 0.5 mL NBiL 培养基代替。将培养板放入培养箱中。
- 转染时，按照步骤2制备mPSC多转染试剂。
- 向 DNA：OptiMEM 混合物中加入 26 μL OptiMEM：转染试剂混合物。通过移液约10次快速而剧烈地混合试剂。让混合混合物在室温下孵育 5 分钟。
- 将混合混合物滴加到孔中。将培养板放入培养箱中。24 小时后更换介质。
6. 流式细胞术
- 转染后48小时从转染的24孔板中吸出培养基。
- 向每个孔中加入200μL胰蛋白酶，涡旋，并在37°C下孵育30秒。 敲击板的侧面并加入 200 μL 冰冷的 FACS 缓冲液（PBS 中的 2% FBS）。
- 从 A1 开始，打开并标记 V 底 96 孔板。在转染板上混合每个孔的内容物以去除细胞，并用 P200 移液管制备单细胞溶液。将 200 μL 从每个孔转移到 96 孔板上的相应孔中。
- 将 15 mL FACS 缓冲液加入 50 mL 试剂储槽中。在室温下以300× g 离心板5分钟。通过将 96 孔板倒入水槽中以快速平稳的运动弃去上清液。
- 使用多通道移液器将沉淀重悬于试剂储液槽的 150 μL FACS 缓冲液中，重悬于 96 孔板上。重复步骤 6.4-6.5 两次。将 96 孔板放入避光的装满冰的盒子中。
- 通过流式细胞仪运行样品以获得荧光报告基因的群体分布。
- 确保细胞仪在激光和滤光片组合方面适合进行实验（例如，如果无法激发或检测远红外光谱，则不要使用红外报告基因）。
- 包括用于标准化磁珠的其他样品，以便在分析过程中对数据进行 MEFL 转换。确保每个样品收集足够的细胞进行适当的统计分析9.
- 从原始细胞仪文件中转换荧光单位，并使用几种方法中的任何一种分析数据，例如基于Python或MATLAB的管道或市售软件9,13。
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Representative Results
正向和反向转染都依赖于细胞膜与传入的转染试剂-DNA 复合物之间的相互作用，从而允许将 NA 递送至受体细胞。这些技术的不同之处在于细胞递送时的状态 - 在传统的正向转染中，DNA通常递送至贴壁细胞单层，而反向转染则依赖于试剂-DNA复合物在单细胞悬浮液中与细胞相遇。在细胞不以均匀、扁平的单层形式生长，而是采用更圆顶或菌落状形态的情况下，这种差异尤其重要，就像 mPSC 一样。可以采用传统转染的其他变体，例如进行多转染而不是共转染。这种修饰改变了给定治疗中每种DNA物种的相对分布，使研究人员能够快速探索表型与其质粒剂量之间的关系。在进行这些实验时，对细胞仪本身进行标准化和质量控制也很重要。根据既定方案13，以下几个实验的荧光单元已归一化为荧光珠标准品，以便跨实验日进行准确比较（补充图1）。如图所示，手动对细胞进行门控（补充图2）。
鉴于mPSC的集落形态，传统的正向转染方法将受到直接暴露于周围培养基的细胞数量的限制。与反向转染相比，正向转染的标记物阳性细胞比例显著降低（少>3倍， p < 0.05， 图1A），尽管平均递送至细胞群的DNA量不显著降低（~1.3倍， 图1B）。
有趣的是，孵育时间显着影响了报告基因阳性细胞的比例，但不影响阳性细胞中平均报告基因表达（图2A，B）。孵育细胞长达 20 分钟可增加报告基因阳性细胞的百分比，超过 40 分钟可降低该百分比。至关重要的是，虽然通过将试剂直接加入含有传代细胞的孔中进行反向转染，但阳性率和平均表达水平最高，同时也导致所选终点处存活细胞数量减少。虽然孵育超过该方案建议的 5 分钟时可以看到转染效率的提高，但建议谨慎行事，因为长时间的扰动可能会对干细胞状态和分化能力产生影响6。为了阐明多反转和共反转和正向转染对转染后细胞整体生长的影响，我们在转染后 48 小时进行了细胞计数（图 3）。对于多转染和共转染，与反向转染相比，正向转染显著减少了所选终点处的细胞数量。在反向或正向转染中比较多转染和共转染时，未观察到显著差异。
在比较正向和反向多转染时，在反向转染的情况下，转染效率明显更高（图4A）。当三个荧光报告基因被递送到细胞中时，正向转染产生的三阳性细胞数量明显低于反向处理中观察到的细胞数量。转染效率差异的结果也可以从多转染群体的结果分布中看出（图4B）。虽然两者探索的总比率范围大致相同，但在正向多转染的情况下，整个分布的细胞总数不足。当将这些条件与共转染进行比较时，可以看出递送的DNA比率存在差异：共转染通常导致大约1：1：1的递送，而多转染则在几个对数倍范围内递送报告基因。
当观察反向多转染的DNA比率的整体分布时，可以体会到提高效率的优势（图4B）。虽然正向转染和反向转染都能很好地表示接近 DNA 实际混合比例 （1：1：1） 的比率，但反向条件的比率动态范围扩大，可以很好地代表。
图1：小鼠胚胎干细胞正向和反向转染的转染效率比较。 在单次洗涤和接种之前，用 GFP 载体转染试剂复合物处理逆转录转染细胞 5 分钟。转染后 48 小时通过流式细胞术定量效率。25,000 个细胞用 1 μL 阳离子脂质转染试剂和 500 ng DNA 处理，适用于所有情况。（A） 通过 反向或正向转染转染的细胞的阳性百分比比较。GFP阳性细胞是通过对非转染细胞进行门控来测定的，此外，在混合群体的每种处理中鉴定非转染细胞。（B） 比较通过正向或反向转染转染 GFP 阳性的细胞群的平均荧光强度。误差线表示平均值和 1 个标准差。数据对应于 3 个独立的重复，每个重复来自不同的传代号。根据双尾 t 检验 显示显著差异 （*p < 0.05）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：将 GFP 载体反向转染到小鼠胚胎干细胞中的孵育时间滴定。 将细胞与 1 μL 阳离子脂质转染试剂和 500 ng DNA 混合不同时间，然后洗涤并铺板。过夜处理包括将细胞直接接种到含有转染试剂-DNA 复合物的孔中，并在 18 小时后更换培养基进行处理。通过流式细胞术定量GFP表达。（A） GFP载体转染阳性细胞的平均荧光强度比较。（B） 比较与基于GFP载体的基于脂质的转染试剂复合物孵育不同时间后，每个处理中表达GFP报告基因的细胞百分比。GFP阳性细胞是通过对非转染细胞进行门控来测定的，此外，在混合群体的每种处理中鉴定非转染细胞。误差线表示平均值和 1 个标准差。数据对应于 3 个独立的重复，每个重复来自不同的传代号。根据双尾 t 检验 ，显示出显著差异 （*p < 0.05）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：共反向转染和多反向转染和正向转染之间的丰度比较。 用 500 ng 载体 DNA 和 1 μL 阳离子脂质转染试剂转染细胞，然后在 48 小时后收获血细胞计数器活细胞计数。将细胞计数归一化为非转染对照。误差线表示平均值和 1 个标准差。数据对应于 3 个独立的重复，每个重复来自不同的传代号。根据双尾 t 检验 ，显示出显著差异 （*p < 0.05）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：小鼠胚胎干细胞的三种报告基因转染比较了正向和反向多转染和共转染技术。 用 1 μL 阳离子脂质转染试剂和 500 ng DNA（GFP、RFP 和 BFP 表达载体各 167 ng）在室温下处理细胞 5 分钟。48小时后 通过 流式细胞术分析细胞。（A） 所有分析的细胞中所有三个报告基因均呈阳性的比例。除了在混合群体的每种处理中鉴定非转染细胞外，还通过对未转染细胞进行门控来确定报告阳性细胞。误差线表示平均值和 1 个标准差。数据对应于 3 个独立的重复，每个重复来自不同的传代号。根据双尾 t 检验 ，显示出显著差异 （*p < 0.05）。（B） 报告基因表达在三阳性人群中的分布。对于分析的每个给定细胞，将 BFP 和 RFP 信号归一化为 GFP 信号，然后根据条件绘制以可视化每个细胞的 DNA 载体比率。图分布被着色为伪彩色图，取决于给定空间的细胞密度。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充图1：校准曲线。 标准校准曲线，用于将GFP通道（B525_FITC_A）中的任意荧光单元归一化为等效荧光素（MEFL）分子。使用流式细胞术数据分析仪生成和执行标准曲线和归一化。 请点击此处下载此文件。
补充图 2：用于确定单个标记物阳性百分比的门控策略示例。 细胞图首先 通过（ FSC-A vs.SSC-A），然后对细胞进行双峰门控（FSC-W 与。FSC-H）。通过使用非转染群体并门控，使该群体的 1% 在门内，可以产生阳性门百分比。 请点击此处下载此文件。
补充文件1：本研究中使用的DNA/质粒序列。请点击此处下载此文件。
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Discussion
转染方案被广泛采用的一个关键原因是其可重复性和可及性;然而，这些协议确实需要跨实验环境进行优化。上述未提及的是首次尝试转染新细胞系时所需的标准测试。首先，转染试剂的选择是关键，因为市售试剂不是万能的，而且不同细胞类型的NA递送活力效率会有所不同。此外，要找到NA和转染试剂的理想量及其最佳比例，还需要进行测试。通常遵循转染试剂供应商推荐的优化步骤就足以达到NA和转染试剂的理想量。
当给定的转染失败时，首先应考虑所用试剂的适用性：考虑 NA 是否经过验证和测序，细胞在转染前是否处于最佳存活状态，转染试剂是否经过批次测试或与其他细胞特异性试剂进行比较。通常，关键对照是在经过测试和验证的启动子的控制下包含表达 GFP 的载体，因为启动子通常具有细胞特异性，在不同的细胞系中具有不同的强度14。除了用户技术错误之外，一旦对给定的转染方案和NA进行了优化，实验结果的较大偏差通常可以追溯到给定试剂的问题。
虽然使用多转染可以进行传统共转染无法实现的几种类型的单罐实验，但它并不总是明确的最佳选择。在必须滴定几种 NA 的比例，或者一种 NA 的存在会以剂量依赖性方式影响其他 NA 的情况下，多转染可以对 NA 进行快速设计-构建-测试循环 8,9。另一方面，多转染不太适合不进行单细胞分析（如流式细胞术）的应用。在这些情况下，可能更需要采用共转染方法来产生同质群体。此外，对于无论优化如何都难以转染的细胞，如果不大幅扩大实验规模，多重转染可能无法在整个分布中产生合适数量的细胞用于下游分析。
最后，无论试剂或优化如何，一些细胞系都不能耐受转染。遗憾的是，此类品系的报告通常不会发表，这限制了有关单个品系的转染性的信息。在这种情况下，可能需要其他 NA 递送方法，例如电穿孔或病毒介导的递送。然而，在可能的情况下，扩展的转染方案（如上文所述的反向多转染技术）为研究人员开辟了一种新的制度，建立在经过时间考验的试剂和方案的基础上。
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Disclosures
作者报告没有利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢由于篇幅限制而未在这项工作中引用的对该领域的许多贡献，以及提供这一机会的资助机构。作者感谢加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）和加拿大卫生研究院（CIHR）的资助，他们支持了这项工作。K.M. 是 NSERC 的 CGS-M 奖学金和不列颠哥伦比亚大学的 Killam 博士奖学金的获得者。NS是迈克尔·史密斯健康研究BC学者奖的获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | MilliporeSigma | SCR005 | |
| Apotransferrin | MilliporeSigma | T1147-500MG | |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| Beta-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Gibco | 15260-037 | |
| CHIR99021 | MilliporeSigma | SML1046-25MG | |
| DMEM-F12 | MilliporeSigma | D6421-24X500ML | |
| Flow cytometry standardization beads | Spherotech | URCP-38-2K | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G1890 | |
| GlutaMAX supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin | Gibco | 12585-0014 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent |
| Neurobasal media | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| PD0325901 | MilliporeSigma | PZ0162-25MG | |
| Progesterone | MilliporeSigma | P8783 | Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Putrescine | MilliporeSigma | P6780 | Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Recombinant mLIF | BioTechne | 8878-LF-500/CF | |
| Sodium selenite | MilliporeSigma | S5261-25G | Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
References
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