Technique de poly-transfection inverse optimisée à base de cellules souches embryonnaires de souris pour l’exploration rapide des ratios d’acides nucléiques

Summary

Le présent protocole décrit une méthode de poly-transfection inverse de cellules souches embryonnaires de souris pendant la culture avec des milieux 2i et LIF. Cette méthode offre une viabilité et une efficacité supérieures à celles des protocoles de transfection directe traditionnels, tout en permettant une optimisation des rapports plasmidiques en un seul pot.

Abstract

En raison de sa relative simplicité et de sa facilité d’utilisation, la transfection transitoire de lignées cellulaires de mammifères avec des acides nucléiques est devenue un pilier de la recherche biomédicale. Bien que la plupart des lignées cellulaires largement utilisées aient des protocoles robustes pour la transfection en culture bidimensionnelle adhérente, ces protocoles ne se traduisent souvent pas bien pour les lignées moins étudiées ou celles dont la morphologie est atypique et difficile à transfecter. En utilisant des cellules souches pluripotentes de souris cultivées dans un milieu 2i/LIF, un modèle de culture largement utilisé pour la médecine régénérative, cette méthode décrit un protocole de transfection inverse optimisé et rapide capable d’atteindre une plus grande efficacité de transfection. En s’appuyant sur ce protocole, une poly-transfection à trois plasmides est effectuée, tirant parti de l’efficacité supérieure à la normale dans l’administration des plasmides pour étudier une gamme élargie de stœchiométrie plasmidique. Ce protocole de poly-transfection inverse permet une méthode expérimentale en un seul pot, permettant aux utilisateurs d’optimiser les rapports plasmidiques dans un seul puits, plutôt que sur plusieurs co-transfections. En facilitant l’exploration rapide de l’effet de la stœchiométrie de l’ADN sur la fonction globale des circuits génétiques délivrés, ce protocole minimise le temps et le coût de la transfection de cellules souches embryonnaires.

Introduction

L’administration d’ADN et d’ARN dans les cellules de mammifères constitue un pilier central de la recherche biomédicale¹. Une méthode courante pour introduire des acides nucléiques exogènes (NA) dans les cellules de mammifères est la transfection transitoire ^2,3. Cette technique repose sur le mélange de NA avec des réactifs de transfection disponibles dans le commerce capables de les délivrer dans les cellules réceptrices. En règle générale, l’AN est délivré par transfection directe, où les cellules adhérant à une surface bidimensionnelle reçoivent le complexe de transfection. Bien que la transfection directe pour les lignées cellulaires établies les plus courantes soit robuste et que les protocoles soient bien publiés, les types de cellules plus spécialisés avec des morphologies non monocouches ne transfectent pas facilement, ce qui limite la quantité d’AN qui peut être délivrée et le nombre de cellules qui la reçoivent.

Les cellules souches pluripotentes (CSP) constituent un modèle attrayant pour comprendre le développement et un outil pour la médecine régénérative, étant donné leur capacité à se diviser indéfiniment et à produire n’importe quel type de cellules corporelles. Pour les CSP de souris (CSPm), les conditions de culture in vitro de routine avec 2 inhibiteurs et LIF (2i/LIF) maintiennent une morphologie de colonie en forme de dôme, limitant directement le nombre de cellules exposées à une transfection vers l’avant ^4,5,6. Pour résoudre ce problème, une transfection inverse peut être effectuée : les cellules sont ajoutées à une boîte contenant un milieu et un réactif de transfection, plutôt que d’ajouter du réactif de transfection aux cellules adhérentes⁷. Bien que cela augmente le nombre de cellules exposées au réactif, cela nécessite également que les cellules soient traversées et transfectées simultanément.

Au-delà des simples transfections d’une seule NA, les chercheurs visent souvent à introduire plusieurs constructions d’AN dans une population de cellules in vitro. Ceci est généralement réalisé par une co-transfection, où les AN sont mélangés à un rapport donné (1:1, 9:1, etc.) et sont ensuite combinés avec le réactif de transfection^{choisi 8}. Cela donne un mélange d’AN et de réactif qui préserve le rapport d’origine des AN les uns par rapport aux autres - bien que les cellules du traitement puissent recevoir des quantités différentes de ce mélange, elles reçoivent toutes le même rapport⁹. Bien que cela soit avantageux lorsque le rapport souhaité de pièces est connu, déterminer ce rapport à l’avance peut demander beaucoup de travail, chaque rapport constituant une condition différente. Une alternative consiste à effectuer une « poly-transfection », où les AN individuels sont mélangés avec le réactif de transfection indépendamment les uns des autres⁹. En combinant des complexes de transfection contenant des AN individuels (plutôt que de combiner des AN avant de créer les complexes), les chercheurs peuvent explorer un large éventail de stœchiométries d’AN en une seule expérience de transfection⁹. Ceci est particulièrement utile dans les cas où les produits de plusieurs NA sont censés interagir les uns avec les autres, comme avec des systèmes de transcription inductibles ou des systèmes avec rétroaction intégrée en ^1,10,11. Cependant, pour le faire efficacement, une efficacité de transfection élevée est nécessaire. En effet, à mesure que le nombre d’AN transfectés uniques augmente, la probabilité qu’une cellule donnée reçoive tous les AN souhaités diminue de façon exponentielle ^9,12.

Le rapport suivant décrit un protocole de transfection inverse pour les CSPm utilisant un réactif de transfection à base de lipides cationiques, dans lequel les cellules sont exposées au mélange réactif-NA pendant un maximum de 5 minutes pour maximiser la viabilité et minimiser le temps en dehors des conditions de culture typiques. La comparaison de ce protocole à la transfection directe standard de ces cellules démontre une efficacité de transfection plus élevée et une augmentation du nombre total de cellules transfectées survivantes. En combinant cette transfection inverse avec une poly-transfection à trois plasmides impliquant de simples rapporteurs fluorescents, un potentiel élargi de criblage des rapports NA avec une efficacité de transfection élevée est démontré.

Protocol

1. Préparation des réactifs pour la culture mPSC

1. Préparez le supplément de N2.
   1. Dans des conditions non stériles, préparer les solutions mères suivantes (étape 1.1.1.1) dans une hotte de sécurité chimique. Ajouter la poudre solide de chaque produit chimique dans un tube conique prépesé de 50 ml. Pesez chaque tube après avoir ajouté la poudre et ajoutez une quantité appropriée de solvant pour atteindre les concentrations ci-dessous. Pour un lot de médias, préparez la quantité minimale indiquée.
      REMARQUE : Les réactifs suivants sont dangereux et doivent être manipulés conformément aux directives locales de sécurité chimique. Assurez-vous d’avoir un EPI approprié lors de la manipulation et ne travaillez qu’avec les formes de poudre solide de ces produits chimiques dans une hotte chimique pour éviter l’inhalation.
      1. Minimum de 0,05 mL de sélénite de sodium dans l’eau à 0,518 mg/mL, 0,5 mL de putrescine dans l’eau à 160 mg/mL, 0,165 mL de progestérone dans de l’éthanol à 100 % à 0,6 mg/mL (voir le tableau des matières).
      2. Conservez les solutions à -20 °C jusqu’à 2 ans.
   2. Dans une enceinte de biosécurité (ESB), ajouter ce qui suit à 58,035 mL de DMEM-F12.
      1. 0,05 mL d’une solution de sélénite de sodium à 0,518 mg/mL, 0,5 mL d’une solution de putrescine à 160 mg/mL, 0,165 mL d’une solution de progestérone à 0,6 mg/mL.
      2. Filtrez stériliser le mélange ci-dessus avec un filtre de 0,22 μm.
   3. Toujours dans le BSC, préparer une solution d’apotransferrine à 100 mg/mL.
      1. Ajouter 5 mL de DMEM-F12 à 500 mg d’apotransferrine (voir le tableau des matières). Remettez lentement en suspension et lavez le récipient en évitant les bulles.
      2. Après avoir remis en suspension et retiré autant que possible avec 5 ml, ajoutez-le à la solution de sélénite/putrescine/progestérone. Prenez plus de la solution précédente et lavez le flacon d’apotransferrine en en sortant le plus possible.
   4. Ajouter 5 mL de BSA à 7,5 % fraction V (voir le tableau des matériaux) à la solution.
   5. Mélanger et aliquote 6,875 mL par tube. Conserver les aliquotes à -80 °C jusqu’à 1 an.
   6. Lorsque vous utilisez les aliquotes N2 ci-dessus pour fabriquer un milieu N2B27, décongelez l’aliquote désirée et ajoutez 3,125 mL d’une solution d’insuline à 4 mg/mL (voir le tableau des matières) à la N2 6,875 pour 10 mL de 100x N2.
2. Préparez le milieu de base N2B27.
   1. Décongeler les suppléments de N2 et de B27 dans un réfrigérateur à 4 °C pendant quelques heures ou toute la nuit.
   2. Dans un BSC, mélanger 484,5 mL de DMEM-F12 et 484,5 mL de milieu neurobasal (voir le tableau des matières) dans un flacon stérile de 1 L.
   3. Ajouter 10 mL de supplément de B27 et 10 mL de supplément de N2 dans le milieu.
   4. Ajouter 1 mL de bêta-mercaptoéthanol 55 mM (voir le tableau des matières). Ajouter 10 mL de glutamax 100x. Mélangez vigoureusement en remuant la bouteille.
   5. Aliquote le volume souhaité par aliquote (généralement 100 mL) et conserver à -80 °C jusqu’à 1 an. Conserver après décongélation à 4 °C jusqu’à 3 semaines.
3. Préparez les médias NBiL.
   1. Décongeler une aliquote de 100 mL de milieu de base N2B27 à -80 °C au réfrigérateur à 4 °C.
   2. Dans une ESB, ajouter le LIF (voir le Tableau des matières) à une concentration finale de 10 μg/L.
   3. Ajouter CHIR99021 (3 μM final) et PD0325901 (1 μM final) (voir le tableau des matériaux). Bien mélanger avec une pipette sérologique de 50 ml. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
4. Préparez une solution de gélatine à 0,2 %.
   1. Transvaser 500 mL de H₂O à double distillation dans une bouteille en verre de 1 L.
   2. Mesurez 1 g de gélatine (voir tableau des matériaux) et ajoutez-la à l’eau. Mélanger en secouant le flacon jusqu’à dissolution quasi totale.
   3. Autoclaver le mélange gélatine et eau à 15 psi, 121 °C pendant 35 min. Une fois refroidi, filtrez-le stériliser avec un filtre de 0,22 μm dans un BSC. Conserver à 4 °C.
5. Préparez le produit de lavage.
   1. Dans une ESB, mélanger 160 μL de BSA à 7,5 % par 10 mL de DMEM-F12.
   2. Mettez à l’échelle ce qui précède et préparez en grande quantité pour faciliter l’utilisation future (par exemple, 8 mL de BSA à 7,5 % pour 500 mL de DMEM-F12). Conserver à 4 °C.

2. Préparation de réactifs pour la poly-transfection mPSC

REMARQUE : Les valeurs suivantes sont fournies pour un seul puits d’une plaque de 24 puits. Les valeurs peuvent être mises à l’échelle en conséquence. Les séquences de tous les ADN/plasmides sont détaillées dans le fichier supplémentaire 1.

1. Calculez le volume de solution d’ADN nécessaire par traitement.
   1. Préparez 500 ng d’ADN par puits/condition.
      1. Si vous transfectez un seul plasmide avec une solution d’ADN de 100 ng/μL, préparez un tube avec 5 μL d’ADN.
      2. Si vous transfectez deux plasmides à 100 ng/μL chacun, préparez deux tubes de 2,5 μL chacun, un pour chaque plasmide.
2. Pour chaque traitement de transfection de 500 ng (voir le tableau des matériaux), aliquote 25 μL d’OptiMEM dans un tube de 1,5 mL.
   1. Pour l’exemple ci-dessus, préparez deux tubes, chacun contenant 250 ng d’ADN (2,5 μL) et 12,5 μL d’OptiMEM.
3. Ajoutez le volume d’ADN requis pour ce traitement à l’OptiMEM dans le tube.
4. Pour chaque tube contenant 500 ng d’ADN et OptiMEM, créez un tube correspondant avec 25 μL supplémentaires d’OptiMEM et 1 μL de réactif de transfection à base de lipides cationiques.
   1. Encore une fois, ces valeurs doivent être mises à l’échelle en conséquence. Pour l’exemple ci-dessus, préparez deux tubes, chacun contenant 12,5 μL d’OptiMEM et 0,5 μL de réactif de transfection.
      REMARQUE : Lors de la mise à l’échelle des valeurs, utilisez la masse d’ADN ajoutée, et non le volume requis pour cette quantité d’ADN. Les réactions avec le réactif de transfection et l’ADN peuvent être mises à l’échelle (par exemple, si 5 puits doivent être transfectés avec le même ADN). Gardez les mêmes ratios de réactifs, mais adaptez-les en conséquence (par exemple, 1000 ng d’ADN : 50 μL OptiMEM : 2 μL réactif de transfection : 50 μL OptiMEM).

3. Préparation des CSPm pour la transfection

REMARQUE : Pour la transfection inverse, préparez le récipient de culture et faites passer les mPSC directement avant d’ajouter les réactifs de transfection. Pour la transfection vers l’avant, le passage et la plaque des cellules 12 à 18 h avant la transfection pour permettre aux cellules d’adhérer à la plaque.

1. Préparez un récipient de culture cellulaire recouvert de gélatine à 0,2 %.
   1. Planifier le nombre de puits nécessaires à la transfection (un puits d’une plaque de 24 puits par traitement/groupe).
   2. Ajouter 200 μL de la solution de gélatine à 0,2 % dans chacun des puits désirés dans la plaque à 24 puits.
   3. Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément la solution, en vous assurant qu’elle couvre tout le fond du puits.
   4. Laisser les puits s’enrober pendant au moins 15 min à température ambiante.
   5. À l’aide d’un aspirateur sous vide, retirez soigneusement les restes de gélatine des puits (inclinez la plaque pour assurer l’élimination de tout liquide sans gratter la couche de gélatine).
   6. Ajouter 0,5 mL de milieu NBiL (étape 1.3) dans chaque puits et laisser la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pour préchauffer.
2. Passage mPSC.
   1. Aliquote 30 mL de produit de lavage (étape 1.5) dans un tube conique de 50 mL.
   2. Aspirer l’ancien milieu de la boîte de culture tissulaire des CSEm.
      REMARQUE : Plusieurs techniques d’aspiration sont permises. Quelle que soit la technique choisie, veillez à ce que les cellules ne restent pas sèches pendant de longues périodes (environ 30 s maximum).
   3. Ajouter la quantité requise de milieu de décollement cellulaire disponible dans le commerce (1,5 mL pour une boîte de 10 cm, échelle en conséquence, voir le tableau des matériaux).
   4. Attendez 3 à 5 minutes avant de pipeter de haut en bas 15 à 20 fois avec une pipette P1000 pour obtenir une suspension unicellulaire. Visualisez les cellules au microscope pour assurer une suspension unicellulaire.
   5. Transférez les cellules du milieu de détachage dans le tube de 50 mL contenant le produit de lavage.
   6. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirez le produit de lavage, en veillant à ce qu’il ne reste aucun liquide résiduel dans le tube.
   7. Remettre la pastille en suspension dans un petit volume de produit de lavage (~300 μL). Comptez la suspension cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre pour obtenir la densité cellulaire.

4. Transfection inverse des mPSC

1. Préparez les réactifs de poly-transfection selon l’étape 2.
2. Préparez le récipient de culture cellulaire et les mPSC de passage conformément à l’étape 3.
3. Aliquote 200 μL de milieu NBiL dans des tubes de 1,5 mL, un pour chaque traitement.
4. Ajouter 26 μL du mélange de réactifs OptiMEM :transfection au mélange ADN :OptiMEM. Mélangez les réactifs rapidement et vigoureusement en pipetant environ 10 fois. Laisser incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.
5. En fonction de la densité cellulaire, transférez le volume requis de cellules de la suspension cellulaire de 300 μL aux tubes NBiL de 200 μL pour obtenir 25 000 cellules par tube.
6. Après 5 min d’incubation de la lipofectamine 2000 (L2K, réactif de transfection) et du mélange d’ADN, ajoutez-le dans le tube de 1,5 mL de cellules et mélangez bien par pipetage. Laissez les cellules incuber avec le réactif pendant 5 min à température ambiante.
7. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Pipeter le liquide en laissant environ 50 μL.
8. Remettre la pastille en suspension avec 100 μL de milieu NBiL. Transférez les cellules sur la plaque et placez la plaque dans l’incubateur. Changez de média 24 h plus tard avec un média NBiL frais.

5. Transfection directe des mPSC

1. 12 à 18 h avant la transfection, préparer le récipient de culture cellulaire et les CSPm de passage conformément à l’étape 3.
2. En fonction de la densité cellulaire, transférez le volume requis de cellules du mélange de cellules de 300 μL pour ensemencer 25 000 cellules par puits. Placez la plaque dans l’incubateur.
3. 1 h avant la transfection, aspirer le média de tous les puits et le remplacer par 0,5 mL de média NBiL. Placez la plaque dans l’incubateur.
4. Au moment de la transfection, préparer les réactifs de poly-transfection mPSC selon l’étape 2.
5. Ajouter 26 μL du mélange de réactifs OptiMEM :transfection au mélange ADN :OptiMEM. Mélangez les réactifs rapidement et vigoureusement en pipetant environ 10 fois. Laisser incuber le mélange combiné à température ambiante pendant 5 min.
6. Ajouter le mélange combiné dans les puits goutte à goutte. Placez la plaque dans l’incubateur. Changez de support 24 h plus tard.

6. Cytométrie en flux

1. Aspirer le fluide de la plaque transfectée à 24 puits 48 h après la transfection.
2. Ajouter 200 μL de trypsine dans chaque puits, agiter et incuber pendant 30 s à 37 °C. Tapotez les côtés de la plaque et ajoutez 200 μL de tampon FACS glacé (2 % FBS dans PBS).
3. Ouvrez et étiquetez une plaque à fond en V de 96 puits, en commençant par A1. Mélangez le contenu de chaque puits sur la plaque transfectée pour déloger les cellules et préparer des solutions unicellulaires avec une pipette P200. Transférer 200 μL de chaque puits au puits approprié sur la plaque de 96 puits.
4. Ajouter 15 mL de tampon FACS dans un réservoir de réactif de 50 mL. Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Jetez le surnageant en inversant la plaque à 96 puits dans l’évier d’un mouvement rapide et fluide.
5. Utilisez une pipette multicanaux pour remettre les pastilles en suspension sur la plaque à 96 puits dans 150 μL de tampon FACS du réservoir de réactif. Répétez deux fois les étapes 6.4-6.5. Placez la plaque de 96 puits dans une boîte remplie de glace à l’abri de la lumière.
6. Passez les échantillons dans un cytomètre en flux pour obtenir les distributions de population des rapporteurs fluorescents.
   1. S’assurer que le cytomètre est approprié en termes de combinaisons laser et filtre pour l’expérience à réaliser (p. ex., ne pas utiliser de rapporteur infrarouge s’il n’est pas possible d’exciter ou de détecter dans le spectre rouge lointain).
   2. Inclure des échantillons supplémentaires pour les billes de normalisation afin de permettre la conversion MEFL des données pendant l’analyse. S’assurer qu’un nombre suffisant de cellules sont prélevées par échantillon pour une analyse statistique appropriée⁹.
7. Convertissez les unités fluorescentes à partir des fichiers de cytomètres bruts et analysez les données à l’aide de plusieurs méthodes, telles que des pipelines basés sur Python ou MATLAB ou des logiciels disponibles dans le commerce ^9,13.

Representative Results

Les transfections directes et inverses reposent sur l’interaction entre la membrane cellulaire et les complexes réactif de transfection entrants-ADN, permettant l’administration de NA aux cellules réceptrices. Là où ces techniques diffèrent, c’est l’état de la cellule lors de l’administration - alors que l’ADN est généralement délivré à des monocouches cellulaires adhérentes dans la transfection directe traditionnelle, la transfection inverse repose plutôt sur la rencontre du complexe réactif-ADN avec les cellules dans une suspension unicellulaire. Cette différence peut être particulièrement cruciale dans les situations où les cellules ne se développent pas comme une monocouche uniforme et plate et adoptent plutôt une morphologie plus bombée ou semblable à une colonie, comme avec les mPSC. D’autres variantes de la transfection traditionnelle peuvent être adoptées, comme la réalisation d’une poly-transfection au lieu d’une co-transfection. Cette modification modifie les distributions relatives de chaque espèce d’ADN dans un traitement donné, permettant aux chercheurs d’explorer rapidement la relation entre le phénotype et le dosage de leurs plasmides. Lors de la réalisation de ces expériences, il est également essentiel d’effectuer la normalisation et le contrôle de la qualité du cytomètre lui-même. Les unités fluorescentes de plusieurs des expériences ci-dessous ont été normalisées à un étalon de billes fluorescentes afin de permettre une comparaison précise entre les jours expérimentaux (figure supplémentaire 1) selon les protocoles établis¹³. Les cellules ont été fermées manuellement, comme indiqué (figure supplémentaire 2).

Compte tenu de la morphologie des colonies de mPSC, les méthodes traditionnelles de transfection directe seraient limitées par le nombre de cellules exposées directement aux milieux environnants. Par rapport aux transfections inverses, les transfections directes présentaient une proportion significativement plus faible de cellules positives pour le marqueur (>3 fois moins, p < 0,05, Figure 1A) malgré une quantité d’ADN non significativement plus faible délivrée en moyenne à la population de cellules (~1,3 fois, Figure 1B).

Il est intéressant de noter que le temps d’incubation a affecté de manière significative la proportion de cellules positives pour le rapporteur, mais pas l’expression moyenne du rapporteur dans les cellules positives (Figure 2A,B). L’incubation des cellules pendant 20 minutes a augmenté le pourcentage de cellules positives pour le déclarant, avec plus de 40 minutes diminuant ce pourcentage. De manière critique, alors que l’exécution de la transfection inverse en ajoutant le réactif directement dans le puits avec les cellules passées a donné les niveaux d’expression positifs et moyens les plus élevés, elle a également entraîné un nombre inférieur de cellules survivantes au point final choisi. Bien qu’une augmentation de l’efficacité de la transfection puisse être observée lors de l’incubation au-delà des 5 minutes suggérées pour ce protocole, la prudence est de mise car une perturbation prolongée peut avoir des conséquences sur l’état et la capacité de différenciation des cellules souches⁶. Pour clarifier l’impact des transfections poly- et co-inverses et directes sur la croissance globale des cellules après la transfection, nous avons effectué un comptage des cellules 48 heures après la transfection (Figure 3). Pour la polytransfection et la co-transfection, la réalisation d’une transfection directe a considérablement réduit le nombre de cellules présentes au point d’extrémité choisi par rapport aux transfections inverses. Aucune différence significative n’a été observée lors de la comparaison entre la polytransfection et la co-transfection dans les transfections inverses ou directes.

Lorsque l’on compare la polytransfection directe et inverse, on observe une efficacité de transfection plus élevée dans le cas des transfections inverses (Figure 4A). Avec trois rapporteurs fluorescents délivrés aux cellules, le nombre de cellules triple positif résultant des transfections vers l’avant est significativement inférieur à celui observé dans les traitements inverses. Le résultat de la différence d’efficacité de transfection peut également être vu dans les distributions résultantes pour les populations poly-transfectées (Figure 4B). Bien que la gamme totale des rapports explorés par les deux soit à peu près la même, le nombre total de cellules dans la distribution est insuffisant dans le cas de la poly-transfection directe. En comparant ces conditions aux co-transfections, on peut observer une différence dans les rapports d’ADN délivrés : alors que la co-transfection entraîne généralement une livraison d’environ 1:1:1, la poly-transfection délivre les rapporteurs sur plusieurs plages log-fold.

En observant la distribution globale des rapports d’ADN pour une poly-transfection inverse, l’avantage de l’efficacité accrue peut être apprécié (Figure 4B). Alors que la transfection directe et inverse donne une bonne représentation des rapports qui sont proches du rapport mixte réel de l’ADN (1:1:1), la condition inverse a une plage dynamique étendue de rapports qui sont bien représentés.

Figure 1 : Comparaison de l’efficacité de la transfection entre les transfections avant et arrière dans les cellules souches embryonnaires de souris. Les cellules transfectées inversement ont été traitées avec des complexes de réactifs vecteur-transfection GFP pendant 5 minutes avant un seul lavage et un seul placage. L’efficacité a été quantifiée par cytométrie en flux 48 h après la transfection. 25 000 cellules ont été traitées avec 1 μL de réactif de transfection à base de lipides cationiques et 500 ng d’ADN pour toutes les conditions. (A) Comparaison du pourcentage positif pour les cellules transfectées par transfection inverse ou directe. Les cellules positives à la GFP ont été déterminées par contrôle contre les cellules non transfectées en plus d’identifier les cellules non transfectées dans chaque traitement dans la population mixte. (B) Comparaison de l’intensité moyenne de fluorescence de populations de cellules transfectées positives pour la GFP par transfection directe ou inverse. Les barres d’erreur représentent la moyenne et 1 écart-type. Les données correspondent à 3 répétitions indépendantes, chacune provenant d’un numéro de passage différent. Des différences significatives selon les tests t bilatéraux sont indiquées (*p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Titrage du temps d’incubation pour les transfections inverses d’un vecteur GFP dans des cellules souches embryonnaires de souris. Les cellules ont été mélangées avec 1 μL de réactif de transfection à base de lipides cationiques et 500 ng d’ADN pendant des durées variables avant d’être lavées et mises en plaques. Les traitements de nuit consistaient à placer les cellules directement dans des puits contenant des complexes réactif de transfection-ADN, avec un milieu de remplacement pour le traitement 18 heures plus tard. L’expression de la GFP a été quantifiée par cytométrie en flux. (A) Comparaison de l’intensité moyenne de fluorescence des cellules transfectées positives pour un vecteur GFP. (B) Comparaison du pourcentage de cellules dans chaque traitement qui ont exprimé le rapporteur GFP après différentes durées d’incubation avec des complexes réactifs de transfection à base de lipides cationiques vectoriels GFP. Les cellules positives à la GFP ont été déterminées par contrôle contre les cellules non transfectées en plus d’identifier les cellules non transfectées dans chaque traitement dans la population mixte. Les barres d’erreur représentent la moyenne et 1 écart-type. Les données correspondent à 3 répétitions indépendantes, chacune provenant d’un numéro de passage différent. Des différences significatives selon les tests t bilatéraux sont indiquées (*p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Comparaison de l’abondance entre les transfections co- et poly- inverses et directes. Les cellules ont été transfectées avec 500 ng d’ADN vecteur et 1 μL de réactif de transfection à base de lipides cationiques, puis récoltées pour le nombre de cellules vivantes de l’hémocytomètre 48 heures plus tard. Le nombre de cellules a été normalisé par rapport aux témoins non transfectés. Les barres d’erreur représentent la moyenne et 1 écart-type. Les données correspondent à 3 répétitions indépendantes, chacune provenant d’un numéro de passage différent. Des différences significatives selon les tests t bilatéraux sont indiquées (*p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Transfection à trois rapporteurs de cellules souches embryonnaires de souris comparant les techniques de poly- et de co-transfection directe et inverse. Les cellules ont été traitées pendant 5 minutes à température ambiante avec 1 μL de réactif de transfection à base de lipides cationiques et 500 ng d’ADN (167 ng de vecteurs d’expression GFP, RFP et BFP). 48 h plus tard, les cellules ont été analysées par cytométrie en flux. (A) Proportion de toutes les cellules analysées qui étaient positives pour les trois déclarants. Les cellules rapporteures positives ont été déterminées par contrôle contre les cellules non transfectées en plus d’identifier les cellules non transfectées dans chaque traitement dans la population mixte. Les barres d’erreur représentent la moyenne et 1 écart-type. Les données correspondent à 3 répétitions indépendantes, chacune provenant d’un numéro de passage différent. Des différences significatives selon les tests t bilatéraux sont indiquées (*p < 0,05). (B) Répartition de l’expression du déclarant au sein de la population triplement positive. Les signaux BFP et RFP ont été normalisés en signaux GFP pour chaque cellule analysée, puis tracés par condition pour visualiser les ratios de vecteur d’ADN par cellule. La distribution des parcelles a été colorée comme une parcelle en pseudo-couleur, en fonction de la densité des cellules dans un espace donné. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Courbe d’étalonnage. Courbe d’étalonnage standard utilisée pour normaliser des unités fluorescentes arbitraires dans le canal GFP (B525_FITC_A) en molécules de fluorescéine équivalente (MEFL). Les courbes standard et la normalisation ont été générées et effectuées à l’aide d’un analyseur de données de cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Exemple de stratégie de contrôle pour déterminer le pourcentage positif pour un seul marqueur. Les tracés de cellules sont d’abord contrôlés pour les cellules via (FSC-A vs. SSC-A) et ensuite les cellules sont fermées pour les doublets (FSC-W vs. FSC-H). Le pourcentage de portes positives est généré en utilisant une population non transfectée et en bloquant de telle sorte que 1 % de cette population se trouve à l’intérieur de la porte. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Séquences de l’ADN/plasmides utilisés dans la présente étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’une des principales raisons de l’adoption généralisée des protocoles de transfection est leur reproductibilité et leur accessibilité ; cependant, ces protocoles nécessitent une optimisation dans des contextes expérimentaux. Les tests standard requis lors de la première tentative de transfectation d’une nouvelle lignée cellulaire ne sont pas mentionnés ci-dessus. Tout d’abord, le choix du réactif de transfection est essentiel, car les réactifs disponibles dans le commerce ne sont pas universels et l’efficacité de la viabilité de l’administration d’AN varie selon les types de cellules. De plus, trouver la quantité idéale de réactif NA et de transfection, ainsi que leur rapport optimal, nécessite des tests. Souvent, il suffit de suivre les étapes d’optimisation recommandées par le fournisseur de réactifs de transfection pour arriver à la quantité idéale de réactif NA et de réactif de transfection.

Lorsqu’une transfection donnée a échoué, la première considération doit être l’adéquation des réactifs utilisés : déterminer si l’AN est validé et séquencé, si les cellules sont dans un état de viabilité optimale avant la transfection, si le réactif de transfection a été testé en lot ou comparé à d’autres réactifs plus spécifiques aux cellules. Souvent, un contrôle critique est l’inclusion d’un vecteur exprimant la GFP sous le contrôle d’un promoteur testé et validé, car les promoteurs sont souvent connus pour être spécifiques aux cellules, avec des forces différentes dans différentes lignées cellulaires¹⁴. En dehors de l’erreur technique de l’utilisateur, une fois qu’un protocole de transfection et une AN donnés ont été optimisés, de grands écarts dans les résultats expérimentaux peuvent souvent être attribués à des problèmes avec un réactif donné.

Bien que l’utilisation de la poly-transfection permette plusieurs types d’expériences en un seul pot qui sont irréalisables avec les co-transfections traditionnelles, ce n’est pas toujours le meilleur choix. Dans les cas où le rapport de plusieurs NA doit être titré, ou lorsque la présence d’un NA influencera les autres de manière dose-dépendante, la poly-transfection permet de réaliser des cycles rapides de conception-construction-test avec les NA ^8,9. D’autre part, les poly-transfections ne sont pas bien adaptées aux applications où l’analyse de cellules uniques, comme la cytométrie en flux, n’est pas effectuée. Dans ces cas, une approche de co-transfection pour produire une population homogène peut être plus souhaitable. De plus, pour les cellules difficiles à transfecter quelle que soit l’optimisation, les poly-transfections peuvent ne pas produire un nombre approprié de cellules sur l’ensemble de la distribution pour une analyse en aval sans une forte mise à l’échelle de l’expérience.

Enfin, certaines lignées cellulaires ne tolèrent pas la transfection, quel que soit le réactif ou l’optimisation. Malheureusement, les rapports sur ces lignées ne sont généralement pas publiés, ce qui limite les informations sur la transfectabilité d’une lignée individuelle. Dans de tels cas, d’autres méthodes d’administration NA peuvent être nécessaires, telles que l’électroporation ou l’administration médiée par un virus. Dans la mesure du possible, cependant, les protocoles de transfection élargis tels que les techniques de polytransfection inverse décrites ci-dessus ouvrent un nouveau régime pour les chercheurs, en s’appuyant sur des réactifs et des protocoles éprouvés.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056