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Developmental Biology

Uma técnica otimizada de politransfecção reversa baseada em células-tronco embrionárias de camundongo para rápida exploração de proporções de ácidos nucleicos

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Biomedical Engineering, University of British Columbia

Summary

O presente protocolo descreve um método de politransfecção reversa de células-tronco embrionárias de camundongos durante o cultivo com meios 2i e LIP. Este método produz maior viabilidade e eficiência do que os protocolos tradicionais de transfecção direta, ao mesmo tempo em que permite a otimização one-pot das proporções plasmidiais.

Abstract

Devido à sua relativa simplicidade e facilidade de uso, a transfecção transitória de linhagens celulares de mamíferos com ácidos nucléicos tornou-se um pilar na pesquisa biomédica. Embora as linhagens celulares mais utilizadas possuam protocolos robustos para transfecção em cultura bidimensional aderente, esses protocolos muitas vezes não se traduzem bem para linhagens menos estudadas ou com morfologias atípicas e difíceis de transfectar. Usando células-tronco pluripotentes de camundongos cultivadas em meios 2i/LIF, um modelo de cultura amplamente utilizado para medicina regenerativa, este método delineia um protocolo de transfecção reversa rápido e otimizado capaz de alcançar maior eficiência de transfecção. Aproveitando este protocolo, uma politransfecção de três plasmídeos é realizada, aproveitando a eficiência maior do que o normal na entrega de plasmídeos para estudar uma gama expandida de estequiometria de plasmídeos. Este protocolo de politransfecção reversa permite um método experimental de um pote, permitindo que os usuários otimizem as proporções de plasmídeos em um único poço, em vez de em várias cotransfecções. Ao facilitar a rápida exploração do efeito da estequiometria do DNA na função global dos circuitos genéticos liberados, este protocolo minimiza o tempo e o custo da transfecção de células-tronco embrionárias.

Introduction

A entrega de DNA e RNA em células de mamíferos serve como um pilar central da pesquisa biomédica1. Um método comum para a introdução de ácidos nucléicos (NA) exógenos em células de mamíferos é por transfecção transitória 2,3. Essa técnica baseia-se na mistura de NA com reagentes de transfecção disponíveis comercialmente, capazes de entregá-los nas células receptoras. Normalmente, o NA é liberado via transfecção anterior, onde as células aderidas a uma superfície bidimensional recebem o complexo de transfecção. Enquanto a transfecção direta para as linhagens celulares estabelecidas mais comuns é robusta e os protocolos são bem publicados, tipos celulares de nicho com morfologias não monocamadas não transfectam facilmente, limitando a quantidade de NA que pode ser entregue e o número de células que o recebem.

As células-tronco pluripotentes (PSCs) servem como um modelo atraente para a compreensão do desenvolvimento e como uma ferramenta para a medicina regenerativa, dada sua capacidade de se dividir indefinidamente e produzir qualquer tipo de célula corporal. Para PSCs de camundongos (mPSCs), condições rotineiras de cultivo in vitro com 2 inibidores e LIF (2i/LIF) mantêm uma morfologia de colônia semelhante a uma cúpula, limitando diretamente o número de células expostas a uma transfecção anterior 4,5,6. Para resolver isso, uma transfecção reversa pode ser realizada: células são adicionadas a uma placa contendo meio e reagente de transfecção, em vez de adicionar reagente de transfecção às células aderentes7. Embora isso aumente o número de células expostas ao reagente, também requer que as células sejam passadas e transfectadas simultaneamente.

Indo além de simples transfecções de NA único, os pesquisadores geralmente visam entregar várias construções de NA em uma população de células in vitro. Isso é tipicamente conseguido através de uma co-transfecção, onde os NAs são misturados em uma determinada proporção (1:1, 9:1, etc.) e são então combinados com o reagente de transfecção escolhido8. Isso produz uma mistura de NAs e reagentes que preserva a proporção original de NAs entre si - enquanto as células em tratamento podem receber quantidades diferentes dessa mistura, todas recebem a mesma proporção9. Embora isso seja vantajoso quando a proporção desejada de partes é conhecida, determinar essa proporção antecipadamente pode ser trabalhoso, com cada razão constituindo uma condição diferente. Uma alternativa é realizar uma "politransfecção", em que os AEs individuais são misturados com o reagente de transfecção independentemente uns dos outros9. Ao combinar complexos de transfecção contendo NAs individuais (em vez de combinar NAs antes de criar os complexos), os pesquisadores podem explorar uma ampla gama de estequiometrias de NA em um único experimento de transfecção9. Isso é particularmente valioso nos casos em que se espera que os produtos de vários NAs interajam entre si, como com sistemas de transcrição induzíveis ou sistemas com feedback embutido 1,10,11. No entanto, para fazê-lo de forma eficaz, uma alta eficiência de transfecção é necessária. De fato, à medida que o número de NAs únicos transfectados aumenta, a probabilidade de uma dada célula receber todos os NAs desejados diminui exponencialmente 9,12.

O relato a seguir descreve um protocolo de transfecção reversa para mPSCs usando um reagente de transfecção catiônico baseado em lipídios, no qual as células são expostas à mistura reagente-NA por no máximo 5 min para maximizar a viabilidade e minimizar o tempo fora das condições típicas de cultura. A comparação deste protocolo com a transfecção direta padrão dessas células demonstra uma maior eficiência de transfecção e um aumento no número total de células transfectadas sobreviventes. Combinando esta transfecção reversa com uma politransfecção de três plasmídeos envolvendo repórteres fluorescentes simples, um potencial expandido para rastrear razões de NA com alta eficiência de transfecção é demonstrado.

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Protocol

1. Preparação de reagentes para cultura mPSC

  1. Preparar suplemento N2.
    1. Em condições não estéreis, preparar as seguintes soluções-mãe (passo 1.1.1.1) num exaustor de segurança química. Adicione o pó sólido de cada produto químico a um tubo cônico de 50 mL pré-pesado. Pesar cada tubo após a adição do pó e adicionar uma quantidade adequada de solvente para atingir as concentrações abaixo. Para um lote de mídia, prepare a quantidade mínima listada.
      NOTA: Os reagentes a seguir são perigosos e devem ser manuseados de acordo com as diretrizes locais de segurança química. Certifique-se de EPI adequado ao manusear e trabalhe apenas com as formas sólidas em pó desses produtos químicos em uma capela de fumaça química para evitar a inalação.
      1. Mínimo de 0,05 mL de selenito de sódio em água a 0,518 mg/mL, 0,5 mL de putrescina em água a 160 mg/mL, 0,165 mL de progesterona em etanol 100% a 0,6 mg/mL (ver Tabela de Materiais).
      2. Armazene soluções a -20 °C por até 2 anos.
    2. Em uma cabine de biossegurança (BSC), adicionar o seguinte a 58.035 mL de DMEM-F12.
      1. 0,05 ml de solução de selenito de sódio 0,518 mg/ml, 0,5 ml de solução de putrescina a 160 mg/ml, 0,165 ml de solução de progesterona 0,6 mg/ml.
      2. Filtrar esterilizar a mistura acima com um filtro de 0,22 μm.
    3. Ainda no BSC, preparar uma solução de 100 mg/mL de apotransferrina.
      1. Adicionar 5 ml de DMEM-F12 a 500 mg de apotransferrina (ver Tabela de Materiais). Ressuspenda lentamente e lave o recipiente, evitando bolhas.
      2. Depois de ressuspender e remover o máximo possível com 5 mL, adicioná-lo à solução de selenito/putrescina/progesterona. Tome mais da solução anterior e lave o frasco de apotransferrina, tirando o máximo possível.
    4. Adicionar 5 ml de fracção V de BSA a 7,5% (ver Tabela de Materiais) à solução.
    5. Misture e alíquota 6,875 mL por tubo. Guarde alíquotas a -80 °C por até 1 ano.
    6. Ao usar as alíquotas N2 acima para fazer o meio N2B27, descongele a alíquota desejada e adicione 3,125 mL de uma solução de insulina 4 mg/mL (ver Tabela de Materiais) ao 6,875 N2 para 10 mL de 100x N2.
  2. Preparar meios basais N2B27.
    1. Descongele os suplementos de N2 e B27 em uma geladeira de 4 °C por algumas horas ou durante a noite.
    2. Em um BSC, misturar 484,5 mL de DMEM-F12 e 484,5 mL de meio Neurobasal (ver Tabela de Materiais) em um frasco estéril de 1 L.
    3. Adicionar 10 mL de B27 e 10 mL de suplemento N2 à mídia.
    4. Adicionar 1 ml de beta-mercaptoetanol 55 mM (ver Tabela de Materiais). Adicionar 10 mL de 100x glutamax. Misture vigorosamente girando o frasco.
    5. Aliquota o volume desejado por alíquota (normalmente 100 mL) e armazenar a -80 °C por até 1 ano. Conservar em utilização após descongelamento a 4 °C durante um período máximo de 3 semanas.
  3. Preparar mídia NBiL.
    1. Descongelar uma alíquota de 100 mL de meio basal N2B27 de -80 °C na geladeira de 4 °C.
    2. Em um BSC, adicionar LIF (ver Tabela de Materiais) a uma concentração final de 10 μg/L.
    3. Adicionar CHIR99021 (3 μM final) e PD0325901 (1 μM final) (ver Tabela de Materiais). Misture bem com uma pipeta sorológica de 50 mL. Conservar a 4 °C até 2 semanas.
  4. Preparar solução de gelatina a 0,2%.
    1. Transfira 500 mL de H2O bidestilado para um frasco de vidro de 1 L.
    2. Meça 1 g de gelatina (ver Tabela de Materiais) e junte-a à água. Misture agitando o frasco até dissolver.
    3. Autoclave a mistura de gelatina e água a 15 psi, 121 °C por 35 min. Uma vez resfriado, esterilizá-lo com um filtro de 0,22 μm em um BSC. Conservar a 4 °C.
  5. Prepare meios de lavagem.
    1. Em um BSC, misturar 160 μL de BSA 7,5% por 10 mL de DMEM-F12.
    2. Dimensione o acima e prepare em grandes quantidades para facilitar o uso futuro (por exemplo, 8 mL de BSA 7,5% a 500 mL de DMEM-F12). Conservar a 4 °C.

2. Preparação de reagentes para politransfecção de mPSC

NOTA: Os seguintes valores são fornecidos para um único poço de uma placa de 24 poços. Os valores podem ser dimensionados de acordo. As sequências de todos os DNA/plasmídeos estão detalhadas no Arquivo Suplementar 1.

  1. Calcular o volume de solução de DNA necessário por tratamento.
    1. Preparar 500 ng de DNA por poço/condição.
      1. Se transfectar um único plasmídeo com uma solução de DNA de 100 ng/μL, prepare um tubo com 5 μL de DNA.
      2. Se transfectar dois plasmídeos a 100 ng/μL cada, prepare dois tubos com 2,5 μL em cada, um para cada plasmídeo.
  2. Em um BSC, execute o seguinte: Para cada tratamento de transfecção de 500 ng (ver Tabela de Materiais), alíquota 25 μL de OptiMEM em um tubo de 1,5 mL.
    1. Dimensione isso de acordo - para o exemplo acima, prepare dois tubos, cada um com 250 ng de DNA (2,5 μL) e 12,5 μL de OptiMEM.
  3. Adicione o volume de ADN necessário para esse tratamento ao OptiMEM no tubo.
  4. Para cada tubo com 500 ng de DNA e OptiMEM, crie um tubo correspondente com mais 25 μL de OptiMEM e 1 μL de reagente de transfecção catiônico à base de lipídios.
    1. Novamente, esses valores devem ser dimensionados de acordo. Para o exemplo acima, prepare dois tubos, cada um com 12,5 μL de OptiMEM e 0,5 μL de reagente de transfecção.
      NOTA: Ao escalar valores, use a massa de DNA adicionada, não o volume necessário para essa quantidade de DNA. As reações com reagente de transfecção e DNA podem ser dimensionadas (por exemplo, se 5 poços forem transfectados com o mesmo DNA). Mantenha as proporções de reagentes iguais, mas dimensione de acordo (por exemplo, DNA de 1000 ng: 50 μL OptiMEM: reagente de transfecção de 2 μL: 50 μL OptiMEM).

3. Preparação de mPSCs para transfecção

NOTA: Para a transfecção reversa, prepare o recipiente de cultura e passe diretamente pelos mPSCs antes de adicionar os reagentes de transfecção. Para a transfecção direta, passagem e placa as células 12-18 h antes da transfecção para permitir que as células para aderir à placa.

  1. Preparar um vaso de cultura celular revestido com gelatina a 0,2%.
    1. Planejar o número de poços necessários para a transfecção (um poço de uma placa de 24 poços por tratamento/grupo).
    2. Adicionar 200 μL da solução de gelatina a 0,2% a cada um dos poços desejados na placa de 24 poços.
    3. Agite suavemente a placa para espalhar uniformemente a solução, garantindo que ela cubra todo o fundo do poço.
    4. Deixe os poços revestirem por um mínimo de 15 min à temperatura ambiente.
    5. Usando um aspirador a vácuo, remova cuidadosamente qualquer sobra de gelatina dos poços (incline a placa para garantir a remoção de todo o líquido sem raspar a camada de gelatina).
    6. Adicionar 0,5 mL de meio NBiL (passo 1.3) a cada poço e deixar a placa em incubadora de cultura de tecidos para pré-aquecimento.
  2. Passagem mPSCs.
    1. Alíquota 30 mL de meio de lavagem (passo 1.5) em um tubo cônico de 50 mL.
    2. Aspirar o meio antigo da placa de cultura de tecidos de mESCs.
      NOTA: Várias técnicas de aspiração são permitidas. Seja qual for a técnica escolhida, certifique-se de que as células não permaneçam secas por longos períodos (aproximadamente 30 s no máximo).
    3. Adicione a quantidade necessária de meio de detenção celular disponível comercialmente (1,5 mL para um prato de 10 cm, dimensione de acordo, consulte Tabela de Materiais).
    4. Aguarde 3-5 minutos antes de pipetar para cima e para baixo 15-20 vezes com uma pipeta P1000 para obter uma suspensão de célula única. Visualize as células sob um microscópio para garantir uma suspensão de célula única.
    5. Transfira as células do meio de detenção para o tubo de 50 mL contendo o meio de lavagem.
    6. Centrifugar a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o meio de lavagem, garantindo que nenhum líquido residual permaneça no tubo.
    7. Ressuspenda o pellet em um pequeno volume de meio de lavagem (~300 μL). Contar a suspensão celular usando um hemocitômetro para obter a densidade celular.

4. Transfecção reversa de mPSCs

  1. Preparar reagentes de politransfecção de acordo com o passo 2.
  2. Preparar o vaso de cultura celular e passar mPSCs de acordo com a etapa 3.
  3. Alíquota 200 μL de meio NBiL para tubos de 1,5 mL, um para cada tratamento.
  4. Adicionar 26 μL da mistura de reagentes OptiMEM:transfection à mistura DNA:OptiMEM. Misture os reagentes de forma rápida e vigorosa pipetando aproximadamente 10 vezes. Deixe a mistura incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
  5. Com base na densidade celular, transfira o volume necessário de células da suspensão de 300 μL para os tubos NBiL de 200 μL para obter 25.000 células por tubo.
  6. Após 5 min de incubação da mistura de Lipofectamina 2000 (L2K, reagente de transfecção) e DNA, adicione-a ao tubo de 1,5 mL das células e misture bem por pipetagem. Deixar as células incubarem com o reagente durante 5 minutos à temperatura ambiente.
  7. Centrifugar a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Pipetar o líquido, deixando aproximadamente 50 μL.
  8. Ressuspender o pellet de células com 100 μL de meio NBiL. Transfira as células para a placa e coloque a placa na incubadora. Mude a mídia 24 h depois com uma nova mídia NBiL.

5. Transfecção direta de mPSCs

  1. 12-18 h antes da transfecção, preparar o vaso de cultura celular e passagem mPSCs de acordo com o passo 3.
  2. Com base na densidade celular, transfira o volume necessário de células da mistura de 300 μL para semear 25.000 células por poço. Coloque a placa na incubadora.
  3. 1 h antes da transfecção, aspirar o meio de todos os poços e substituí-lo por 0,5 mL de meio NBiL. Coloque a placa na incubadora.
  4. No momento da transfecção, preparar reagentes de politransfecção mPSC de acordo com o passo 2.
  5. Adicionar 26 μL da mistura de reagentes OptiMEM:transfection à mistura DNA:OptiMEM. Misture os reagentes de forma rápida e vigorosa pipetando aproximadamente 10 vezes. Deixe a mistura combinada incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos.
  6. Adicione a mistura combinada aos poços gota a gota. Coloque a placa na incubadora. Mude a mídia 24 h depois.

6. Citometria de fluxo

  1. Aspirar o meio da placa transfectada de 24 poços 48 h após a transfecção.
  2. Adicionar 200 μL de tripsina a cada poço, agitar e incubar durante 30 s a 37 °C. Toque nas laterais da placa e adicione 200 μL de tampão FACS gelado (2% FBS em PBS).
  3. Abra e rotule uma placa de 96 poços com fundo em V, a partir da A1. Misture o conteúdo de cada poço na placa transfectada para desalojar as células e fazer soluções unicelulares com uma pipeta P200. Transfira 200 μL de cada poço para o poço apropriado na placa de 96 poços.
  4. Adicionar 15 mL de tampão FACS a um reservatório de reagente de 50 mL. Centrifugar a placa a 300 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante invertendo a placa de 96 poços na pia com um movimento rápido e suave.
  5. Use uma pipeta multicanal para ressuspender os pellets na placa de 96 poços em 150 μL de tampão FACS do reservatório de reagente. Repita as etapas 6.4-6.5 duas vezes. Coloque a placa de 96 poços em uma caixa cheia de gelo protegida da luz.
  6. Execute as amostras através de um citômetro de fluxo para obter as distribuições populacionais dos repórteres fluorescentes.
    1. Certifique-se de que o citômetro seja apropriado em termos de combinações de laser e filtro para o experimento a ser realizado (por exemplo, não use um repórter infravermelho se não for possível excitar ou detectar no espectro vermelho distante).
    2. Inclua amostras adicionais para contas de padronização para permitir a conversão MEFL dos dados durante a análise. Garantir que sejam recolhidas células suficientes por amostra para uma análise estatística adequada9.
  7. Converter unidades fluorescentes dos arquivos brutos do citômetro e analisar os dados usando qualquer um dos vários métodos, como pipelines baseados em Python ou MATLAB ou software disponível comercialmente 9,13.

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Representative Results

Tanto a transfecção direta quanto a reversa dependem da interação entre a membrana celular e os complexos reagente-DNA da transfecção de entrada, permitindo a entrega de NA às células receptoras. Onde essas técnicas diferem é o estado da célula após a entrega - enquanto o DNA é tipicamente entregue a monocamadas celulares aderentes na transfecção direta tradicional, a transfecção reversa depende de ter o complexo reagente-DNA encontrando as células enquanto em uma suspensão de célula única. Essa diferença pode ser particularmente crucial em situações em que as células não crescem como uma monocamada uniforme e plana e, em vez disso, adotam uma morfologia mais abobadada ou semelhante a colônias, como acontece com as mPSCs. Variações adicionais na transfecção tradicional podem ser adotadas, como a realização de uma politransfecção em vez de uma co-transfecção. Essa modificação altera as distribuições relativas de cada espécie de DNA em um determinado tratamento, permitindo que os pesquisadores explorem rapidamente a relação entre o fenótipo e a dosagem de seus plasmídeos. Ao realizar esses experimentos, também é fundamental realizar a padronização e o controle de qualidade do próprio citômetro. As unidades fluorescentes de vários dos experimentos abaixo foram normalizadas para um padrão de esferas fluorescentes para permitir uma comparação precisa entre os dias experimentais (Figura 1 Suplementar), de acordo com os protocolos estabelecidos13. As células foram fechadas manualmente, como mostra a Figura 2 Suplementar.

Dada a morfologia das colônias de mPSCs, os métodos tradicionais de transfecção direta seriam limitados pelo número de células expostas diretamente ao meio circundante. Quando comparadas às transfecções reversas, as transfecções anteriores apresentaram uma proporção significativamente menor de células positivas para o marcador (>3 vezes menos, p < 0,05, Figura 1A), apesar de terem uma quantidade não significativamente menor de DNA entregue em média à população de células (~1,3 vezes, Figura 1B).

Curiosamente, o tempo de incubação afetou significativamente a proporção de células positivas para o repórter, mas não a expressão média do repórter nas células positivas (Figura 2A,B). Incubar células por até 20 min aumentou a porcentagem de células positivas para o repórter, com mais de 40 min diminuindo essa porcentagem. Criticamente, ao realizar a transfecção reversa adicionando o reagente diretamente no poço com células passadas deu os mais altos níveis de expressão %-positiva e média, também resultou em um menor número de células sobreviventes no desfecho escolhido. Embora um aumento na eficiência da transfecção possa ser observado quando incubadas além dos 5 min sugeridos para esse protocolo, recomenda-se cautela, pois perturbações prolongadas podem ter consequências para o estado das células-tronco e a capacidade dediferenciação6. Para esclarecer o impacto das transfecções poli e co-reversa e direta no crescimento global das células após a transfecção, realizamos contagens de células 48 h após a transfecção (Figura 3). Tanto para a poli quanto para a co-transfecção, a realização de uma transfecção direta diminuiu significativamente o número de células presentes no desfecho escolhido quando comparada às transfecções reversas. Não houve diferença significativa na comparação entre poli e cotransfecção nas transfecções reversa ou anterior.

Quando se compara a politransfecção direta e reversa, observa-se maior eficiência de transfecção no caso das transfecções reversas (Figura 4A). Com três repórteres fluorescentes sendo entregues às células, o número de células triplo-positivas resultantes de transfecções anteriores é significativamente menor do que as observadas nos tratamentos reversos. O resultado da diferença na eficiência da transfecção também pode ser visto nas distribuições resultantes para as populações politransfectadas (Figura 4B). Embora a gama total de razões exploradas por ambos seja aproximadamente a mesma, o número total de células ao longo da distribuição está ausente no caso da politransfecção direta. Ao comparar essas condições com as cotransfecções, uma diferença nas proporções de DNA entregues pode ser vista: enquanto a co-transfecção normalmente resulta em uma entrega de aproximadamente 1:1:1, a politransfecção entrega os repórteres em uma faixa de várias dobras logarítmicas.

Ao observar a distribuição global das razões de DNA para uma politransfecção reversa, a vantagem do aumento da eficiência pode ser apreciada (Figura 4B). Enquanto a transfecção direta e reversa fornecem uma boa representação de razões que são próximas da razão mista real do DNA (1:1:1), a condição inversa tem uma faixa dinâmica expandida de razões que são bem representadas.

Figure 1
Figura 1: Comparação da eficiência da transfecção entre transfecções direta e reversa em células-tronco embrionárias de camundongos. As células transfectadas reversas foram tratadas com complexos reagentes vetor-transfecção de GFP por 5 minutos antes de uma única lavagem e plaqueamento. A eficiência foi quantificada por citometria de fluxo 48 h após a transfecção. 25.000 células foram tratadas com 1 μL de reagente de transfecção catiônico à base de lipídios e 500 ng de DNA para todas as condições. (A) Comparação de percentagens positivas para células transfectadas por transfecção reversa ou anterior. As células positivas para GFP foram determinadas por acoplamento contra células não transfectadas, além da identificação de células não transfectadas em cada tratamento na população mista. (B) Comparação da intensidade média de fluorescência de populações de células transfectadas positivas para GFP via transfecção direta ou reversa. As barras de erro representam a média e 1 desvio padrão. Os dados correspondem a 3 réplicas independentes, cada uma de um número de passagem diferente. Diferenças significativas de acordo com o teste t bicaudal são indicadas (*p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Titulação do tempo de incubação para transfecções reversas de um vetor GFP em células-tronco embrionárias de camundongos. As células foram misturadas com 1 μL de reagente de transfecção catiônico à base de lipídios e 500 ng de DNA por vários períodos de tempo antes de serem lavadas e plaqueadas. Os tratamentos noturnos consistiram em células sendo plaqueadas diretamente em poços contendo complexos reagente de transfecção e DNA, com um meio substituto para o tratamento 18 h depois. A expressão de GFP foi quantificada por citometria de fluxo. (A) Comparação da intensidade média de fluorescência de células transfectadas positivas para um vetor de GFP. (B) Comparação da porcentagem de células em cada tratamento que expressou o repórter de GFP após várias durações de incubação com complexos reagentes de transfecção baseados em vetor catiônico de GFP. As células positivas para GFP foram determinadas por acoplamento contra células não transfectadas, além da identificação de células não transfectadas em cada tratamento na população mista. As barras de erro representam a média e 1 desvio padrão. Os dados correspondem a 3 réplicas independentes, cada uma de um número de passagem diferente. Diferenças significativas de acordo com o teste t bicaudal são indicadas (*p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Comparação da abundância entre as transfecções co- e poli-reversas e posteriores. As células foram transfectadas com 500 ng de DNA vetorial e 1 μL de reagente de transfecção catiônico à base de lipídios e, em seguida, colhidas para contagem de células vivas do hemocitômetro 48 h depois. A contagem de células foi normalizada para controles não transfectados. As barras de erro representam a média e 1 desvio padrão. Os dados correspondem a 3 réplicas independentes, cada uma de um número de passagem diferente. Diferenças significativas de acordo com o teste t bicaudal são indicadas (*p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Três repórteres de transfecção de células-tronco embrionárias de camundongos comparando técnicas de poli e co-transfecção direta e reversa. As células foram tratadas por 5 min à temperatura ambiente com 1 μL de reagente de transfecção catiônico à base de lipídios e 500 ng de DNA (167 ng cada um dos vetores de expressão de GFP, RFP e BFP). 48 h depois, as células foram analisadas por citometria de fluxo. (A) Proporção de todas as células analisadas que foram positivas para os três repórteres. As células Reporter-positive foram determinadas por acoplamento contra células não transfectadas, além da identificação de células não transfectadas em cada tratamento na população mista. As barras de erro representam a média e 1 desvio padrão. Os dados correspondem a 3 réplicas independentes, cada uma de um número de passagem diferente. Diferenças significativas de acordo com o teste t bicaudal são indicadas (*p < 0,05). (B) Distribuição da expressão do repórter na população triplo-positiva. Os sinais de BFP e RFP foram normalizados para sinais de GFP para cada célula analisada e, em seguida, plotados por condição para visualizar as proporções de vetor de DNA por célula. A distritubação da parcela foi colorida como uma parcela pseudocolorida, dependente da densidade de células em um determinado espaço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar 1: Curva de calibração. Curva de calibração padrão usada para normalizar unidades fluorescentes arbitrárias no canal GFP (B525_FITC_A) para moléculas de fluoresceína equivalente (MEFL). Curvas padrão e normalização foram geradas e realizadas usando um analisador de dados de citometria de fluxo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Exemplo de estratégia de gating para determinar a porcentagem positiva para um único marcador. As parcelas de células são primeiro fechadas para células via (FSC-A vs. SSC-A) e, em seguida, as células são fechadas para duplos (FSC-W vs. FSC-H). A porcentagem de portões positivos é gerada usando uma população não transfectada e fechando de tal forma que 1% dessa população está dentro do portão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Sequências do DNA/plasmídeos utilizados no presente estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Uma das principais razões para a ampla adoção de protocolos de transfecção é sua reprodutibilidade e acessibilidade; no entanto, esses protocolos requerem otimização em contextos experimentais. Não mencionado acima é o teste padrão exigido ao tentar transfectar uma nova linhagem celular pela primeira vez. Primeiro, a escolha do reagente de transfecção é fundamental, pois os reagentes comercialmente disponíveis não são únicos e variam na eficiência da viabilidade da entrega de NA entre os tipos celulares. Além disso, encontrar a quantidade ideal de NA e reagente de transfecção, bem como sua proporção ideal, requer testes. Muitas vezes, seguir as etapas de otimização recomendadas pelo fornecedor de reagentes de transfecção é suficiente para chegar à quantidade ideal de NA e reagente de transfecção.

Quando uma determinada transfecção falhou, a primeira consideração deve ser a adequação dos reagentes usados: considerar se o NA é validado e sequenciado, se as células estão em um estado otimamente viável antes da transfecção, se o reagente de transfecção foi testado por lote ou comparado com outros reagentes mais específicos para células. Muitas vezes, um controle crítico é a inclusão de um vetor que expressa GFP sob o controle de um promotor testado e validado, pois os promotores são frequentemente conhecidos por serem células-específicos, com diferentes forças em diferentes linhagens celulares14. Fora do erro técnico do usuário, uma vez que um determinado protocolo de transfecção e NA tenha sido otimizado, grandes desvios nos resultados experimentais podem muitas vezes ser atribuídos a problemas com um determinado reagente.

Embora o uso da politransfecção possibilite vários tipos de experimentos de panela única que são inviáveis com as co-transfecções tradicionais, nem sempre é a melhor escolha clara. Nos casos em que a proporção de vários NA deve ser titulada, ou em que a presença de um NA influenciará os demais de forma dose-dependente, a politransfecção possibilita a realização de ciclos rápidos de projeto-construção-teste com NAs 8,9. Por outro lado, as politransfecções não são adequadas para aplicações onde a análise de célula única, como a citometria de fluxo, não está sendo realizada. Nesses casos, uma abordagem de co-transfecção para produzir uma população homogênea pode ser mais desejável. Além disso, para células que são difíceis de transfectar independentemente da otimização, as politransfecções podem não produzir um número adequado de células em toda a distribuição para análise a jusante sem aumentar fortemente o experimento.

Finalmente, algumas linhagens celulares não toleram transfecção, independentemente do reagente ou otimização. Infelizmente, relatórios sobre tais linhas normalmente não são publicados, limitando as informações sobre a transfectabilidade de uma linha individual. Nesses casos, outros métodos de entrega de NA podem ser necessários, como eletroporação ou parto mediado por vírus. Quando possível, no entanto, protocolos expandidos de transfecção, como as técnicas de politransfecção reversa, como descrito acima, abrem um novo regime para os pesquisadores, com base em reagentes e protocolos testados no tempo.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer as muitas contribuições para a área que não foram citadas neste trabalho devido a limitações de espaço, bem como as agências de fomento que proporcionaram essa oportunidade. Os autores agradecem o financiamento do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), que apoiaram este trabalho. K.M. recebeu uma bolsa CGS-M do NSERC e uma bolsa de doutorado Killam da Universidade da Colúmbia Britânica. N.S. recebeu o Michael Smith Health Research BC Scholar Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase  MilliporeSigma SCR005
Apotransferrin  MilliporeSigma T1147-500MG
B27 supplement  ThermoFisher Scientific  17504044
Beta-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific  21985023
BSA fraction V (7.5%) Gibco 15260-037
CHIR99021  MilliporeSigma SML1046-25MG
DMEM-F12 MilliporeSigma D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads Spherotech URCP-38-2K
Gelatin  MilliporeSigma G1890
GlutaMAX supplement  ThermoFisher Scientific  35050061
Insulin  Gibco 12585-0014
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11668-019 Transfection reagent
Neurobasal media ThermoFisher Scientific  21103049
OptiMEM  Invitrogen 31985-070
PD0325901  MilliporeSigma PZ0162-25MG
Progesterone MilliporeSigma P8783 Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine MilliporeSigma P6780 Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF  BioTechne 8878-LF-500/CF
Sodium selenite  MilliporeSigma S5261-25G Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA ThermoFisher Scientific  25200056

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References

  1. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
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  3. FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  4. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. PLoS One. 8 (12), 81156 (2013).
  5. Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. K. The many faces of pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states. BMC Developmental Biology. 17 (1), (2017).
  6. Mulas, C., et al. Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells. Development. 146 (6), Cambridge, England. 173146 (2019).
  7. Tamm, C., Kadekar, S., Pijuan-Galitó, S., Annerén, C. Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 584-591 (2016).
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  14. Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PLoS One. 5 (5), 0010611 (2010).

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Biologia do Desenvolvimento Edição 202
Uma técnica otimizada de politransfecção reversa baseada em células-tronco embrionárias de camundongo para rápida exploração de proporções de ácidos nucleicos
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Maheden, K., Hwang, K., Egilmez, I., … More

Maheden, K., Hwang, K., Egilmez, I., Shakiba, N. An Optimized Mouse Embryonic Stem Cell Based Reverse Poly-Transfection Technique for Rapid Exploration of Nucleic Acid Ratios. J. Vis. Exp. (202), e65766, doi:10.3791/65766 (2023).

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