O presente protocolo descreve um método de politransfecção reversa de células-tronco embrionárias de camundongos durante o cultivo com meios 2i e LIP. Este método produz maior viabilidade e eficiência do que os protocolos tradicionais de transfecção direta, ao mesmo tempo em que permite a otimização one-pot das proporções plasmidiais.
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Artigo de método
Uma técnica otimizada de politransfecção reversa baseada em células-tronco embrionárias de camundongo para rápida exploração de proporções de ácidos nucleicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Devido à sua relativa simplicidade e facilidade de uso, a transfecção transitória de linhagens celulares de mamíferos com ácidos nucléicos tornou-se um pilar na pesquisa biomédica. Embora as linhagens celulares mais utilizadas possuam protocolos robustos para transfecção em cultura bidimensional aderente, esses protocolos muitas vezes não se traduzem bem para linhagens menos estudadas ou com morfologias atípicas e difíceis de transfectar. Usando células-tronco pluripotentes de camundongos cultivadas em meios 2i/LIF, um modelo de cultura amplamente utilizado para medicina regenerativa, este método delineia um protocolo de transfecção reversa rápido e otimizado capaz de alcançar maior eficiência de transfecção. Aproveitando este protocolo, uma politransfecção de três plasmídeos é realizada, aproveitando a eficiência maior do que o normal na entrega de plasmídeos para estudar uma gama expandida de estequiometria de plasmídeos. Este protocolo de politransfecção reversa permite um método experimental de um pote, permitindo que os usuários otimizem as proporções de plasmídeos em um único poço, em vez de em várias cotransfecções. Ao facilitar a rápida exploração do efeito da estequiometria do DNA na função global dos circuitos genéticos liberados, este protocolo minimiza o tempo e o custo da transfecção de células-tronco embrionárias.
Introdução
A entrega de DNA e RNA em células de mamíferos serve como um pilar central da pesquisa biomédica1. Um método comum para a introdução de ácidos nucléicos (NA) exógenos em células de mamíferos é por transfecção transitória 2,3. Essa técnica baseia-se na mistura de NA com reagentes de transfecção disponíveis comercialmente, capazes de entregá-los nas células receptoras. Normalmente, o NA é liberado via transfecção anterior, onde as células aderidas a uma superfície bidimensional recebem o complexo de transfecção. Enquanto a transfecção direta para as linhagens celular....
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Protocolo
1. Preparação de reagentes para cultura mPSC
- Preparar suplemento N2.
- Em condições não estéreis, preparar as seguintes soluções-mãe (passo 1.1.1.1) num exaustor de segurança química. Adicione o pó sólido de cada produto químico a um tubo cônico de 50 mL pré-pesado. Pesar cada tubo após a adição do pó e adicionar uma quantidade adequada de solvente para atingir as concentrações abaixo. Para um lote de mídia, prepare a quantidade mínima listada.
NOTA: Os reagentes a seguir são perigosos e devem ser manuseados de acordo com as diretrizes locais de segurança química. Certifique-se de EPI adequado ao manusear e trabalhe apenas com as for....
- Em condições não estéreis, preparar as seguintes soluções-mãe (passo 1.1.1.1) num exaustor de segurança química. Adicione o pó sólido de cada produto químico a um tubo cônico de 50 mL pré-pesado. Pesar cada tubo após a adição do pó e adicionar uma quantidade adequada de solvente para atingir as concentrações abaixo. Para um lote de mídia, prepare a quantidade mínima listada.
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Resultados
Tanto a transfecção direta quanto a reversa dependem da interação entre a membrana celular e os complexos reagente-DNA da transfecção de entrada, permitindo a entrega de NA às células receptoras. Onde essas técnicas diferem é o estado da célula após a entrega - enquanto o DNA é tipicamente entregue a monocamadas celulares aderentes na transfecção direta tradicional, a transfecção reversa depende de ter o complexo reagente-DNA encontrando as células enquanto em uma suspensão de célula única. Essa diferença pode ser partic.......
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Discussão
Uma das principais razões para a ampla adoção de protocolos de transfecção é sua reprodutibilidade e acessibilidade; no entanto, esses protocolos requerem otimização em contextos experimentais. Não mencionado acima é o teste padrão exigido ao tentar transfectar uma nova linhagem celular pela primeira vez. Primeiro, a escolha do reagente de transfecção é fundamental, pois os reagentes comercialmente disponíveis não são únicos e variam na eficiência da viabilidade da entrega de NA entre os tipos celulares. Além disso, enco.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer as muitas contribuições para a área que não foram citadas neste trabalho devido a limitações de espaço, bem como as agências de fomento que proporcionaram essa oportunidade. Os autores agradecem o financiamento do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), que apoiaram este trabalho. K.M. recebeu uma bolsa CGS-M do NSERC e uma bolsa de doutorado Killam da Universidade da Colúmbia Britânica. N.S. recebeu o Michael Smith Health Research BC Scholar Award.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Accutase | MilliporeSigma | SCR005 | |
| Apotransferrina | Suplemento MilliporeSigma | T1147-500MG | |
| B27 | ThermoFisher Scientific | ||
| Beta-mercaptoetanol | ThermoFisher Scientific | ||
| BSA fração V (7,5%) | Gibco | 15260-037 | |
| CHIR99021 | MilliporeSigma | SML1046-25MG | |
| DMEM-F12 | MilliporeSigma | D6421-24X500ML | |
| Contas de padronização de citometria de fluxo | Spherotech | URCP-38-2K | |
| Gelatina | Suplemento MilliporeSigma | G1890 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | ||
| Insulina | Gibco | 12585-0014 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Reagente de transfecção |
| Mídia neurobasal | ThermoFisher Scientific | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| PD0325901 | MilliporeSigma | PZ0162-25MG | |
| Progesterona | MilliporeSigma | P8783 | Perigo químico - consulte as diretrizes de segurança locais, certifique-se de que o EPI adequado esteja sendo usado e trabalhe com a forma de pó sólido apenas em uma capela de exaustão química |
| Putrescina | MilliporeSigma | P6780 | Perigo químico - consulte as diretrizes de segurança locais, certifique-se de que o EPI adequado esteja sendo usado e trabalhe com a forma de pó sólido apenas em uma capela |
| de exaustão químicaMMIF recombinante | BioTechne | 8878-LF-500/CF | |
| Selenito de sódio | MilliporeSigma | S5261-25G | Perigo químico - consulte as diretrizes de segurança locais, certifique-se de que o EPI adequado está sendo usado e trabalhe com a forma de pó sólido apenas em um exaustor |
| químico Tripsina-EDTA | ThermoFisher Scientific |
Referências
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Fus-Kujawa, A., et al. An overvie....
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Reimpressões e permissões
