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Developmental Biology

न्यूक्लिक एसिड अनुपात के तेजी से अन्वेषण के लिए एक अनुकूलित माउस भ्रूण स्टेम सेल आधारित रिवर्स पॉली-अभिकर्मक तकनीक

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Biomedical Engineering, University of British Columbia

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल 2i और LIF मीडिया के साथ संस्कृति के दौरान माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के रिवर्स पाली अभिकर्मक के लिए एक विधि का वर्णन करता है. यह विधि पारंपरिक आगे अभिकर्मक प्रोटोकॉल की तुलना में उच्च व्यवहार्यता और दक्षता पैदावार, जबकि भी प्लाज्मिड अनुपात के एक पॉट अनुकूलन को सक्षम करने.

Abstract

इसकी सापेक्ष सादगी और उपयोग में आसानी के कारण, न्यूक्लिक एसिड के साथ स्तनधारी सेल लाइनों का क्षणिक अभिकर्मक जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक मुख्य आधार बन गया है। जबकि सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल सेल लाइनों पक्षपाती दो आयामी संस्कृति में अभिकर्मक के लिए मजबूत प्रोटोकॉल है, इन प्रोटोकॉल अक्सर कम अध्ययन लाइनों या atypical, मुश्किल से ट्रांसफ़ेक्ट आकृति विज्ञान के साथ उन लोगों के लिए अच्छी तरह से अनुवाद नहीं करते. 2i/LIF मीडिया में उगाए गए माउस प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करना, पुनर्योजी चिकित्सा के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला संस्कृति मॉडल, यह विधि एक अनुकूलित, तेजी से रिवर्स अभिकर्मक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करती है जो उच्च अभिकर्मक दक्षता प्राप्त करने में सक्षम है। इस प्रोटोकॉल का लाभ उठाते हुए, एक तीन-प्लाज्मिड पाली अभिकर्मक किया जाता है, प्लाज्मिड स्टोइकोमेट्री की एक विस्तारित श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए प्लाज्मिड वितरण में सामान्य से अधिक दक्षता का लाभ उठाते हुए। इस रिवर्स पाली अभिकर्मक प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को एक ही अच्छी तरह से प्लाज्मिड अनुपात का अनुकूलन करने के लिए सक्षम करने के बजाय कई सह अभिकर्मक भर में, एक पॉट प्रयोगात्मक विधि के लिए अनुमति देता है. वितरित आनुवंशिक सर्किट के समग्र कार्य पर डीएनए स्टोइकोमेट्री के प्रभाव के तेजी से अन्वेषण की सुविधा के द्वारा, यह प्रोटोकॉल भ्रूण स्टेम सेल अभिकर्मक के समय और लागत को कम करता है।

Introduction

स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए और आरएनए की डिलीवरी जैव चिकित्सा अनुसंधान के मुख्य स्तंभ के रूप में कार्य करतीहै। स्तनधारी कोशिकाओं में बहिर्जात न्यूक्लिक एसिड (एनए) पेश करने के लिए एक आम विधि क्षणिक अभिकर्मक 2,3 के माध्यम से है. यह तकनीक एनए को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक अभिकर्मकों के साथ मिलाने पर निर्भर करती है जो उन्हें प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में पहुंचाने में सक्षम हैं। आमतौर पर, एनए को आगे अभिकर्मक के माध्यम से वितरित किया जाता है, जहां दो आयामी सतह का पालन करने वाली कोशिकाएं अभिकर्मक परिसर प्राप्त करती हैं। जबकि सबसे आम स्थापित सेल लाइनों के लिए आगे अभिकर्मक मजबूत है और प्रोटोकॉल अच्छी तरह से प्रकाशित कर रहे हैं, गैर मोनोलेयर आकृति विज्ञान के साथ अधिक आला सेल प्रकार आसानी से transfect नहीं है, एनए है कि वितरित किया जा सकता है की मात्रा और कोशिकाओं की संख्या है कि इसे प्राप्त सीमित नहीं है.

प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) विकास को समझने के लिए एक आकर्षक मॉडल के रूप में और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए एक उपकरण के रूप में काम करते हैं, अनिश्चित काल तक विभाजित करने और किसी भी शारीरिक कोशिका प्रकार का उत्पादन करने की उनकी क्षमता को देखते हुए। माउस पीएससी (एमपीएससी) के लिए, 2 अवरोधकों और एलआईएफ (2आई/एलआईएफ) के साथ इन विट्रो संस्कृति की स्थिति में नियमित रूप से एक गुंबद जैसी कॉलोनी आकृति विज्ञान बनाए रखते हैं, सीधे आगे अभिकर्मक 4,5,6के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं की संख्या को सीमित करते हैं। इस पते के लिए, एक रिवर्स अभिकर्मक प्रदर्शन किया जा सकता है: कोशिकाओं को मीडिया और अभिकर्मक अभिकर्मक युक्त एक डिश के लिए जोड़ा जाता है, बजाय पक्षपाती कोशिकाओं7 अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ने से. जबकि यह अभिकर्मक के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं की संख्या को बढ़ाता है, इसके लिए कोशिकाओं को समवर्ती रूप से पारित और ट्रांसफ़ेक्ट करने की भी आवश्यकता होती है।

सरल एकल-एनए अभिकर्मक से आगे बढ़ते हुए, शोधकर्ता अक्सर इन विट्रो में कोशिकाओं की आबादी में कई एनए निर्माणों को वितरित करने का लक्ष्य रखते हैं। यह आम तौर पर एक सह अभिकर्मक के माध्यम से हासिल की है, जहां एनए एक दिया अनुपात (1:1, 9:1, आदि) पर मिश्रित कर रहे हैं और फिर चुना अभिकर्मक8 के साथ संयुक्त रहे हैं. यह एनएएस और अभिकर्मक का मिश्रण पैदा करता है जो एनए के मूल अनुपात को एक दूसरे को संरक्षित करता है - जबकि उपचार में कोशिकाओं को इस मिश्रण की अलग-अलग मात्रा प्राप्त हो सकती है, वे सभी समान अनुपात9 प्राप्त करते हैं। हालांकि यह फायदेमंद है जब भागों का वांछित अनुपात ज्ञात होता है, समय से पहले इस अनुपात का निर्धारण श्रम-गहन हो सकता है, जिसमें प्रत्येक अनुपात एक अलग स्थिति का गठन करता है। एक विकल्प एक "पाली अभिकर्मक," जहां व्यक्तिगत एनए एक दूसरे 9 से स्वतंत्र रूप से अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ मिलाया जाता हैप्रदर्शन करने के लिए है. व्यक्तिगत एनए युक्त अभिकर्मक परिसरों के संयोजन से (परिसरों को बनाने से पहले एनए के संयोजन के बजाय), शोधकर्ता एक एकल अभिकर्मक प्रयोग9 में एनए स्टोइकोमेट्री की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगा सकते हैं। यह उन मामलों में विशेष रूप से मूल्यवान है जहां कई एनए के उत्पादों को एक दूसरे के साथ बातचीत करने की उम्मीद है, जैसे कि इंड्यूसिबल ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम या 1,10,11 में निर्मित फीडबैक वाले सिस्टम। हालांकि, प्रभावी ढंग से ऐसा करने के लिए, एक उच्च अभिकर्मक दक्षता की जरूरत है. दरअसल, अद्वितीय ट्रांसफ़ेक्ट एनए की संख्या बढ़ जाती है के रूप में, वांछित एनए के सभी प्राप्त एक दिए गए सेल की संभावनातेजी से 9,12 घट जाती है.

निम्नलिखित रिपोर्ट एक धनायनित लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर mPSCs के लिए एक रिवर्स अभिकर्मक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जिसमें कोशिकाओं को अधिकतम 5 मिनट के लिए अभिकर्मक-एनए मिश्रण के संपर्क में आते हैं व्यवहार्यता को अधिकतम करने और ठेठ संस्कृति की स्थिति के बाहर समय को कम करने के लिए. इन कोशिकाओं के मानक आगे अभिकर्मक के लिए इस प्रोटोकॉल की तुलना एक उच्च अभिकर्मक दक्षता और जीवित ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की कुल संख्या में वृद्धि दर्शाता है. सरल फ्लोरोसेंट पत्रकारों को शामिल एक तीन प्लाज्मिड पाली अभिकर्मक के साथ इस रिवर्स अभिकर्मक के संयोजन से, उच्च अभिकर्मक दक्षता के साथ एनए अनुपात स्क्रीन करने के लिए एक विस्तारित क्षमता का प्रदर्शन किया है.

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Protocol

1. mPSC संस्कृति के लिए अभिकर्मकों की तैयारी

  1. एन 2 पूरक तैयार करें।
    1. गैर-बाँझ स्थितियों में, रासायनिक सुरक्षा धूआं हुड में निम्नलिखित स्टॉक समाधान (चरण 1.1.1.1) तैयार करें। प्रत्येक रसायन के ठोस पाउडर को पूर्व-तौला 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें। पाउडर जोड़ने के बाद प्रत्येक ट्यूब का वजन करें और नीचे सांद्रता प्राप्त करने के लिए उचित मात्रा में विलायक जोड़ें। मीडिया के एक बैच के लिए, सूचीबद्ध न्यूनतम राशि तैयार करें।
      नोट: निम्नलिखित अभिकर्मक खतरनाक हैं और स्थानीय रासायनिक सुरक्षा दिशानिर्देशों के अनुसार नियंत्रित किए जाने चाहिए। हैंडलिंग करते समय उचित पीपीई सुनिश्चित करें, और साँस लेना को रोकने के लिए केवल रासायनिक धूआं हुड में इन रसायनों के ठोस पाउडर रूपों के साथ काम करें।
      1. पानी में न्यूनतम 0.05 एमएल सोडियम सेलेनाइट 0.518 मिलीग्राम/एमएल, 160 मिलीग्राम/एमएल पर पानी में 0.5 एमएल, 0.6 मिलीग्राम/एमएल पर 100% इथेनॉल में प्रोजेस्टेरोन का 0.165 एमएल ( सामग्री की तालिकादेखें)।
      2. 2 साल तक -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर करें।
    2. जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में, डीएमईएम-एफ 12 के 58.035 एमएल में निम्नलिखित जोड़ें।
      1. 0.518 मिलीग्राम/एमएल सोडियम सेलेनाइट समाधान का 0.05 एमएल, 160 मिलीग्राम/एमएल पुट्रेसिन समाधान का 0.5 एमएल, 0.6 मिलीग्राम/एमएल प्रोजेस्टेरोन समाधान का 0.165 एमएल।
      2. फ़िल्टर एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ उपरोक्त मिश्रण बाँझ.
    3. अभी भी बीएससी में, एपोट्रांसफेरिन का 100 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार करें।
      1. डीएमईएम-एफ 12 के 5 एमएल को 500 मिलीग्राम एपोट्रांसफेरिन ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें। बुलबुले से बचने के लिए कंटेनर को धीरे-धीरे फिर से निलंबित करें और धो लें।
      2. 5 एमएल के साथ जितना संभव हो उतना निलंबित करने और हटाने के बाद, इसे सेलेनाइट / पुट्रेसिन / प्रोजेस्टेरोन समाधान में जोड़ें। पिछले समाधान का अधिक लें और एपोट्रांसफरिन बोतल को धो लें, जितना संभव हो उतना बाहर निकालें।
    4. समाधान के लिए 7.5% बीएसए अंश वी ( सामग्री की तालिकादेखें) के 5 एमएल जोड़ें।
    5. मिक्स और विभाज्य 6.875 एमएल प्रति ट्यूब. 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट स्टोर करें।
    6. N2B27 मीडिया बनाने के लिए उपरोक्त N2 एलिकोट का उपयोग करते समय, वांछित विभाज्य को पिघलाएं और 100x N2 के 10 एमएल के लिए 6.875 N2 में 4 मिलीग्राम/एमएल इंसुलिन समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के 3.125 एमएल जोड़ें।
  2. N2B27 बेसल मीडिया तैयार करें।
    1. पिघलना N2 और B27 की खुराक एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में कुछ घंटों या रात भर के लिए.
    2. बीएससी में, डीएमईएम-एफ 12 के 484.5 एमएल और न्यूरोबेसल मीडिया के 484.5 एमएल ( सामग्री की तालिकादेखें) को बाँझ 1 एल बोतल में मिलाएं।
    3. मीडिया में बी 27 के 10 एमएल और एन 2 पूरक के 10 एमएल जोड़ें।
    4. 55 एमएम बीटा-मर्काप्टोएथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)। 100x ग्लूटामैक्स के 10 एमएल जोड़ें। बोतल को घुमाकर जोर से मिलाएं।
    5. विभाज्य प्रति वांछित मात्रा (आमतौर पर 100 एमएल) विभाज्य और 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 3 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलने के बाद उपयोग में स्टोर करें।
  3. NBiL मीडिया तैयार करें।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में -80 डिग्री सेल्सियस से N2B27 बेसल मीडिया के 100 एमएल विभाज्य पिघलना.
    2. बीएससी में, 10 माइक्रोग्राम/एल की अंतिम एकाग्रता में एलआईएफ ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें।
    3. CHIR99021 (3 माइक्रोन अंतिम) और PD0325901 (1 माइक्रोन अंतिम) जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)। एक 50 एमएल सीरोलॉजिकल विंदुक के साथ अच्छी तरह मिलाएं। अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  4. 0.2% जिलेटिन समाधान तैयार करें।
    1. डबल-डिस्टिल्ड एच2ओ के 500 एमएल को 1 एल कांच की बोतल में स्थानांतरित करें।
    2. जिलेटिन के 1 ग्राम को मापें ( सामग्री की तालिकादेखें) और इसे पानी में जोड़ें। बोतल को तब तक हिलाएं जब तक कि ज्यादातर घुल न जाए।
    3. जिलेटिन और पानी के मिश्रण को 15 साई, 35 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव करें। एक बार ठंडा होने पर, बीएससी में 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ इसे स्टरलाइज़ करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. वॉश मीडिया तैयार करें।
    1. बीएससी में, डीएमईएम-एफ 12 के 10 एमएल प्रति 7.5% बीएसए के 160 माइक्रोन मिलाएं।
    2. उपरोक्त स्केल करें और भविष्य में उपयोग में आसानी के लिए बड़ी मात्रा में तैयार करें (उदाहरण के लिए 7.5% बीएसए के 8 एमएल डीएमईएम-एफ 12 के 500 एमएल)। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. mPSC पाली अभिकर्मक के लिए अभिकर्मकों की तैयारी

नोट: निम्नलिखित मूल्यों को एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक भी अच्छी तरह से के लिए प्रदान की जाती हैं. मूल्यों को तदनुसार बढ़ाया जा सकता है। सभी डीएनए/प्लास्मिड के अनुक्रम पूरक फ़ाइल 1 में विस्तृत हैं।

  1. उपचार प्रति आवश्यक डीएनए समाधान की मात्रा की गणना करें।
    1. अच्छी तरह से / हालत प्रति डीएनए के 500 एनजी तैयार करें।
      1. यदि 100 एनजी/माइक्रोन के डीएनए समाधान के साथ एक एकल प्लाज्मिड ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं, तो डीएनए के 5 माइक्रोन के साथ एक ट्यूब तैयार करें।
      2. यदि प्रत्येक 100 एनजी/माइक्रोन पर दो प्लास्मिड ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं, तो प्रत्येक प्लाज्मिड के लिए एक, प्रत्येक में 2.5 माइक्रोन के साथ दो ट्यूब तैयार करें।
  2. बीएससी में, निम्नलिखित कार्य करें: प्रत्येक 500 एनजी अभिकर्मक उपचार ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए, ऑप्टिमम के 25 माइक्रोन को 1.5 एमएल ट्यूब में विभाज्य करें।
    1. तदनुसार इसे स्केल करें - ऊपर दिए गए उदाहरण के लिए, दो ट्यूब तैयार करें, प्रत्येक में 250 एनजी डीएनए (2.5 माइक्रोन) और ऑप्टिमम के 12.5 माइक्रोन हों।
  3. ट्यूब में OptiMEM के लिए उस उपचार के लिए डीएनए की आवश्यक मात्रा जोड़ें।
  4. 500 एनजी डीएनए और OptiMEM के साथ प्रत्येक ट्यूब के लिए, OptiMEM के एक और 25 माइक्रोन और धनायनित लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक के 1 माइक्रोन के साथ एक मिलान ट्यूब बनाएं।
    1. फिर, इन मूल्यों को तदनुसार बढ़ाया जाना चाहिए। उपरोक्त उदाहरण के लिए, दो ट्यूब तैयार करें, जिनमें से प्रत्येक में ऑप्टिमेम के 12.5 माइक्रोन और अभिकर्मक अभिकर्मक के 0.5 माइक्रोन हैं।
      नोट: मूल्यों को स्केल करते समय, डीएनए के द्रव्यमान का उपयोग करें, डीएनए की उस मात्रा के लिए आवश्यक मात्रा नहीं। अभिकर्मक अभिकर्मक और डीएनए के साथ प्रतिक्रियाओं (उदाहरण के लिए, अगर 5 कुओं एक ही डीएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा रहे हैं) बढ़ाया जा सकता है. अभिकर्मकों के अनुपात को समान रखें, लेकिन तदनुसार पैमाने पर (उदाहरण के लिए, 1000 एनजी डीएनए: 50 माइक्रोन ऑप्टिमेम: 2 माइक्रोन अभिकर्मक अभिकर्मक: 50 माइक्रोन ऑप्टिमम)।

3. अभिकर्मक के लिए mPSCs की तैयारी

नोट: रिवर्स अभिकर्मक के लिए, संस्कृति पोत तैयार करें और अभिकर्मक अभिकर्मकों को जोड़ने से पहले सीधे mPSCs को पारित करें। आगे अभिकर्मक के लिए, पारित होने और कोशिकाओं को प्लेट का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए अभिकर्मक से पहले कोशिकाओं 12-18 घंटे थाली.

  1. एक 0.2% जिलेटिन लेपित सेल संस्कृति पोत तैयार करें।
    1. अभिकर्मक (उपचार / समूह प्रति एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुआं) के लिए आवश्यक कुओं की संख्या की योजना.
    2. 24-अच्छी तरह से प्लेट में वांछित कुओं में से प्रत्येक के लिए 0.2% जिलेटिन समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें।
    3. धीरे समान रूप से समाधान फैलाने के लिए थाली हिला, सुनिश्चित करें कि यह अच्छी तरह से के पूरे तल को कवर.
    4. कुओं कमरे के तापमान पर 15 मिनट की एक न्यूनतम के लिए कोट करने के लिए अनुमति दें.
    5. एक वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके, कुओं से किसी भी बचे हुए जिलेटिन को ध्यान से हटा दें (जिलेटिन परत को स्क्रैप किए बिना सभी तरल को हटाने के लिए प्लेट को झुकाएं)।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से एनबीआईएल मीडिया (चरण 1.3) के 0.5 एमएल जोड़ें और प्लेट को टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में प्रीवार्म करने के लिए छोड़ दें।
  2. पैसेज एमपीएससी।
    1. एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में धोने मीडिया (चरण 1.5) के विभाज्य 30 एमएल।
    2. पुराने मीडिया को एमईएससी के टिशू कल्चर डिश से प्रेरित करें।
      नोट: कई आकांक्षा तकनीकों की अनुमति है। जो भी तकनीक चुना जाता है, सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को विस्तारित अवधि (लगभग 30 एस अधिकतम) के लिए शुष्क नहीं रहते हैं.
    3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल डिटैचमेंट माध्यम (10 सेमी डिश के लिए 1.5 एमएल, तदनुसार स्केल , सामग्री की तालिकादेखें) की आवश्यक मात्रा जोड़ें।
    4. एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए एक P1000 विंदुक के साथ 15-20 बार ऊपर और नीचे pipetting से पहले 3-5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें. एक एकल सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के तहत कोशिकाओं को देखें.
    5. डिटैचमेंट माध्यम में कोशिकाओं को वॉश मीडिया युक्त 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। एस्पिरेट वॉश मीडिया, यह सुनिश्चित करता है कि ट्यूब में कोई अवशिष्ट तरल न रहे।
    7. धोने मीडिया (~ 300 माइक्रोन) की एक छोटी मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें। सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल निलंबन की गणना करें।

4. mPSCs का रिवर्स अभिकर्मक

  1. चरण 2 के अनुसार पाली अभिकर्मक अभिकर्मक तैयार करें.
  2. चरण 3 के अनुसार सेल संस्कृति पोत और पारित mPSCs तैयार करें।
  3. 1.5 एमएल ट्यूबों के लिए एनबीआईएल मीडिया के 200 माइक्रोन विभाज्य, प्रत्येक उपचार के लिए एक।
  4. OptiMEM के 26 माइक्रोन जोड़ें: डीएनए में अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण: OptiMEM मिश्रण। अभिकर्मकों को जल्दी और सख्ती से लगभग 10 बार पाइप करके मिलाएं। मिश्रण को 5 मिन के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  5. सेल घनत्व के आधार पर, प्रति ट्यूब 25,000 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 300 माइक्रोन सेल निलंबन से कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा को 200 माइक्रोन एनबीआईएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  6. लिपोफेक्टामाइन 2000 (एल 2 के, अभिकर्मक अभिकर्मक) और डीएनए मिश्रण के इनक्यूबेशन के 5 मिनट के बाद, इसे कोशिकाओं की 1.5 एमएल ट्यूब में जोड़ें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं। कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए अभिकर्मक के साथ सेते हैं.
  7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। पिपेट तरल बाहर, लगभग 50 माइक्रोन छोड़कर।
  8. एनबीआईएल मीडिया के 100 माइक्रोन के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को प्लेट में स्थानांतरित करें और प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें। ताजा NBiL मीडिया के साथ 24 घंटे बाद मीडिया बदलें.

5. mPSCs का फॉरवर्ड ट्रांसफेक्शन

  1. अभिकर्मक से पहले 12-18 घंटे, सेल संस्कृति पोत और चरण 3 के अनुसार पारित mPSCs तैयार करते हैं।
  2. सेल घनत्व के आधार पर, 300 माइक्रोन सेल मिश्रण से कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा को प्रति अच्छी तरह से 25,000 कोशिकाओं के बीज में स्थानांतरित करें। इनक्यूबेटर में थाली रखें.
  3. अभिकर्मक से पहले 1 घंटे, सभी कुओं से मीडिया को महाप्राण करें और इसे एनबीआईएल मीडिया के 0.5 एमएल के साथ बदलें। इनक्यूबेटर में थाली रखें.
  4. अभिकर्मक के समय, चरण 2 के अनुसार mPSC पाली अभिकर्मक अभिकर्मक तैयार करें।
  5. OptiMEM के 26 माइक्रोन जोड़ें: डीएनए में अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण: OptiMEM मिश्रण। अभिकर्मकों को जल्दी और सख्ती से लगभग 10 बार पाइप करके मिलाएं। संयुक्त मिश्रण को 5 मिन के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  6. संयुक्त मिश्रण को कुओं में बूंद-वार डालें। इनक्यूबेटर में थाली रखें. मीडिया 24 घंटे बाद बदलें।

6. फ्लो साइटोमेट्री

  1. अभिकर्मक के बाद ट्रांसफ़ेक्ट 24 अच्छी तरह से थाली 48 घंटे से मीडिया महाप्राण.
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से ट्रिप्सिन के 200 माइक्रोन जोड़ें, भंवर, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए सेते हैं। प्लेट के किनारों को टैप करें और बर्फ-ठंडा एफएसीएस बफर (पीबीएस में 2% एफबीएस) के 200 माइक्रोन जोड़ें।
  3. A1 से शुरू होने वाली V-बॉटम 96-वेल प्लेट खोलें और लेबल करें। कोशिकाओं को नापसंद करने और P200 विंदुक के साथ एकल सेल समाधान बनाने के लिए ट्रांसफ़ेक्ट प्लेट पर प्रत्येक अच्छी तरह से सामग्री मिलाएं। प्रत्येक कुएं से 200 माइक्रोन को 96-अच्छी प्लेट पर उपयुक्त कुएं में स्थानांतरित करें।
  4. एक 50 एमएल अभिकर्मक जलाशय में एफएसीएस बफर के 15 एमएल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर थाली अपकेंद्रित्र. एक तेज और चिकनी आंदोलन के साथ सिंक में 96 अच्छी तरह से थाली पलटना द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  5. अभिकर्मक जलाशय से एफएसीएस बफर के 150 माइक्रोन में 96-अच्छी प्लेट पर छर्रों को फिर से निलंबित करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें। दोहराएँ कदम 6.4-6.5 दो बार. प्रकाश से संरक्षित बर्फ से भरे बॉक्स में 96 अच्छी तरह से थाली रखें.
  6. फ्लोरोसेंट पत्रकारों की जनसंख्या वितरण प्राप्त करने के लिए एक प्रवाह साइटोमीटर के माध्यम से नमूने चलाएं।
    1. सुनिश्चित करें कि साइटोमीटर प्रदर्शन किया जा करने के लिए लेजर और फिल्टर संयोजन के संदर्भ में उपयुक्त है (उदाहरण के लिए, यह उत्तेजित या दूर लाल स्पेक्ट्रम में पता लगाने के लिए संभव नहीं है तो एक अवरक्त रिपोर्टर का उपयोग न करें).
    2. विश्लेषण के दौरान डेटा के एमईएफएल रूपांतरण की अनुमति देने के लिए मानकीकरण मोतियों के लिए अतिरिक्त नमूने शामिल करें। सुनिश्चित करें कि पर्याप्त कोशिकाओं उचित सांख्यिकीय विश्लेषण9 के लिए नमूना प्रति एकत्र कर रहे हैं.
  7. कच्चे साइटोमीटर फ़ाइलों से फ्लोरोसेंट इकाइयों कन्वर्ट और इस तरह के अजगर या MATLAB आधारित पाइपलाइनों या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर 9,13 के रूप में कई विधियों, के किसी भी का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण.

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Representative Results

आगे और रिवर्स दोनों अभिकर्मक कोशिका झिल्ली और आने वाले अभिकर्मक अभिकर्मक डीएनए परिसरों के बीच बातचीत पर भरोसा करते हैं, प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को एनए के वितरण की अनुमति. जहां ये तकनीकें भिन्न होती हैं, प्रसव पर कोशिका की स्थिति होती है - जबकि डीएनए को आमतौर पर पारंपरिक फॉरवर्ड अभिकर्मक में आसन्न सेल मोनोलेयर्स को दिया जाता है, रिवर्स अभिकर्मक इसके बजाय अभिकर्मक-डीएनए कॉम्प्लेक्स कोशिकाओं से मिलने पर निर्भर करता है, जबकि एकल-कोशिका निलंबन में। यह अंतर उन स्थितियों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है जहां कोशिकाएं एक समान, सपाट मोनोलेयर के रूप में विकसित नहीं होती हैं और इसके बजाय अधिक गुंबददार या कॉलोनी जैसी आकृति विज्ञान को अपनाती हैं, जैसा कि एमपीएससी के साथ होता है। पारंपरिक अभिकर्मक पर अतिरिक्त बदलाव इस तरह के एक सह अभिकर्मक के बजाय एक पाली अभिकर्मक प्रदर्शन के रूप में अपनाया जा सकता है. यह संशोधन किसी दिए गए उपचार में प्रत्येक डीएनए प्रजातियों के सापेक्ष वितरण को बदलता है, जिससे शोधकर्ताओं को फेनोटाइप और उनके प्लास्मिड की खुराक के बीच संबंधों का जल्दी से पता लगाने की अनुमति मिलती है। इन प्रयोगों को करते समय, साइटोमीटर के मानकीकरण और गुणवत्ता नियंत्रण को करना भी महत्वपूर्ण है। नीचे दिए गए प्रयोगों में से कई के लिए फ्लोरोसेंट इकाइयों को स्थापित प्रोटोकॉल13 के अनुसार प्रयोगात्मक दिनों (पूरक चित्रा 1) में सटीक तुलना की अनुमति देने के लिए एक फ्लोरोसेंट मनका मानक के लिए सामान्यीकृत किया गया है। कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से दिखाया गया था (पूरक चित्रा 2)।

एमपीएससी की कॉलोनी आकृति विज्ञान को देखते हुए, पारंपरिक आगे अभिकर्मक विधियों आसपास के मीडिया के लिए सीधे उजागर कोशिकाओं की संख्या से सीमित किया जाएगा. जब रिवर्स अभिकर्मक की तुलना में, आगे अभिकर्मक मार्कर के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का एक काफी कम अनुपात था (>3 गुना कम, पी < 0.05, चित्रा 1 ए) डीएनए की एक गैर काफी कम मात्रा कोशिकाओं की आबादी के लिए औसत पर वितरित होने के बावजूद (~ 1.3 गुना, चित्रा 1 बी).

दिलचस्प बात यह है कि इनक्यूबेशन समय ने उन कोशिकाओं के अनुपात को काफी प्रभावित किया जो रिपोर्टर के लिए सकारात्मक थे, लेकिन सकारात्मक कोशिकाओं में औसत रिपोर्टर अभिव्यक्ति नहीं (चित्रा 2ए, बी)। 20 मिनट के रूप में लंबे समय तक कोशिकाओं को इनक्यूबेट करना रिपोर्टर के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत को बढ़ाने के लिए देखा गया था, जिसमें 40 मिनट से अधिक समय तक इस प्रतिशत को कम किया गया था। गंभीर रूप से, जबकि पारित कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से सीधे अभिकर्मक जोड़कर रिवर्स अभिकर्मक प्रदर्शन उच्चतम% सकारात्मक और मतलब अभिव्यक्ति के स्तर दिया, यह भी चुना समापन बिंदु पर जीवित कोशिकाओं की एक कम संख्या में हुई. जबकि अभिकर्मक दक्षता में वृद्धि जब इस प्रोटोकॉल के लिए सुझाव दिया 5 मिनट से परे इनक्यूबेट देखा जा सकता है, सावधानी की सलाह दी है के रूप में लंबे समय तक गड़बड़ी स्टेम सेल राज्य और भेदभाव क्षमता6 के लिए परिणाम हो सकता है. अभिकर्मक के बाद कोशिकाओं के समग्र विकास पर पाली- और सह-रिवर्स और आगे अभिकर्मक के प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए, हमने अभिकर्मक (चित्रा 3)के बाद सेल काउंट 48 घंटे का प्रदर्शन किया। पाली और सह अभिकर्मक दोनों के लिए, एक आगे अभिकर्मक प्रदर्शन काफी रिवर्स अभिकर्मक की तुलना में चुना समापन बिंदु पर मौजूद कोशिकाओं की संख्या में कमी. रिवर्स या फॉरवर्ड ट्रांसफेक्शन के भीतर पॉली- और सह-अभिकर्मक के बीच तुलना करते समय कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया।

आगे और रिवर्स पाली अभिकर्मक की तुलना करते समय, रिवर्स अभिकर्मक (चित्रा 4 ए) के मामले में एक उच्च अभिकर्मक दक्षता है। तीन फ्लोरोसेंट पत्रकारों को कोशिकाओं में वितरित किए जाने के साथ, आगे के अभिकर्मक से उत्पन्न ट्रिपल-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या रिवर्स उपचार में देखे गए लोगों की तुलना में काफी कम है। अभिकर्मक दक्षता में अंतर का परिणाम पाली ट्रांसफ़ेक्ट आबादी (चित्रा 4 बी) के लिए परिणामी वितरण में भी देखा जा सकता है। जबकि दोनों द्वारा खोजे गए अनुपातों की कुल सीमा लगभग समान है, वितरण में कोशिकाओं की कुल संख्या आगे पाली-अभिकर्मक के मामले में कमी है। सह-अभिकर्मक के लिए इन शर्तों की तुलना करते समय, वितरित डीएनए अनुपात में अंतर देखा जा सकता है: जबकि सह-अभिकर्मक आमतौर पर लगभग 1: 1: 1 की डिलीवरी में परिणाम देता है, पॉली-अभिकर्मक पत्रकारों को कई लॉग-गुना रेंज में वितरित करता है।

रिवर्स पॉली-अभिकर्मक के लिए डीएनए अनुपात के समग्र वितरण का अवलोकन करते समय, बढ़ी हुई दक्षता का लाभ (चित्रा 4बी) की सराहना की जा सकती है। जबकि आगे और पीछे अभिकर्मक दोनों अनुपात का एक अच्छा प्रतिनिधित्व देते हैं जो डीएनए (1: 1: 1) के वास्तविक मिश्रित अनुपात के करीब हैं, रिवर्स स्थिति में अनुपात की एक विस्तारित गतिशील रेंज होती है जो अच्छी तरह से प्रतिनिधित्व करती है।

Figure 1
चित्रा 1: माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में आगे और रिवर्स अभिकर्मक के बीच अभिकर्मक दक्षता की तुलना. रिवर्स ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को एक भी धोने और चढ़ाना से पहले 5 मिनट के लिए जीएफपी वेक्टर-अभिकर्मक अभिकर्मक परिसरों के साथ इलाज किया गया था। दक्षता प्रवाह साइटोमेट्री 48 घंटे के बाद अभिकर्मक के माध्यम से मात्रा निर्धारित की गई थी। 25,000 कोशिकाओं को सभी स्थितियों के लिए धनायनित लिपिड-आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक के 1 माइक्रोन और डीएनए के 500 एनजी के साथ इलाज किया गया था। (ए) रिवर्स या फॉरवर्ड ट्रांसफेक्शन के माध्यम से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए प्रतिशत-सकारात्मक की तुलना। जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं को मिश्रित आबादी में प्रत्येक उपचार में गैर-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान करने के अलावा गैर-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के खिलाफ गेटिंग द्वारा निर्धारित किया गया था। (बी)आगे या रिवर्स अभिकर्मक के माध्यम से जीएफपी के लिए सकारात्मक कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट की आबादी की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना। त्रुटि पट्टियाँ माध्य और 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। डेटा 3 स्वतंत्र प्रतिकृतियों से मेल खाती है, प्रत्येक एक अलग मार्ग संख्या से। दो-पूंछ वाले टी-परीक्षणों के अनुसार महत्वपूर्ण अंतर इंगित किए जाते हैं (* पी < 0.05)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में एक जीएफपी वेक्टर के रिवर्स अभिकर्मक के लिए इनक्यूबेशन समय का अनुमाप। कोशिकाओं को धोया और चढ़ाया जाने से पहले विभिन्न मात्रा के लिए धनायनित लिपिड-आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक और डीएनए के 500 एनजी के 1 माइक्रोन के साथ मिलाया गया था। रातोंरात उपचार कोशिकाओं अभिकर्मक डीएनए परिसरों युक्त कुओं में सीधे चढ़ाया जा रहा कोशिकाओं के शामिल थे, उपचार के लिए एक मीडिया प्रतिस्थापन के साथ 18 घंटे बाद में. जीएफपी अभिव्यक्ति प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से मात्रा निर्धारित की गई थी। (ए)जीएफपी वेक्टर के लिए सकारात्मक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना। (बी) जीएफपी वेक्टर-कैजेनिक लिपिड-आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक अभिकर्मक परिसरों के साथ इनक्यूबेशन की विभिन्न अवधियों के बाद जीएफपी रिपोर्टर को व्यक्त करने वाले प्रत्येक उपचार में कोशिकाओं के प्रतिशत की तुलना। जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं को मिश्रित आबादी में प्रत्येक उपचार में गैर-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान करने के अलावा गैर-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के खिलाफ गेटिंग द्वारा निर्धारित किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ माध्य और 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। डेटा 3 स्वतंत्र प्रतिकृतियों से मेल खाती है, प्रत्येक एक अलग मार्ग संख्या से। दो-पूंछ वाले टी-परीक्षणों के अनुसार महत्वपूर्ण अंतर इंगित किए जाते हैं (* पी < 0.05)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सह- और पॉली-रिवर्स और फॉरवर्ड ट्रांसफेक्शन के बीच बहुतायत की तुलना। कोशिकाओं वेक्टर डीएनए के 500 एनजी और धनायनित लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक के 1 माइक्रोन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया, तो हेमोसाइटोमीटर लाइव सेल गिनती 48 घंटे बाद के लिए काटा. सेल मायने रखता है गैर ट्रांसफ़ेक्ट नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत थे. त्रुटि पट्टियाँ माध्य और 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। डेटा 3 स्वतंत्र प्रतिकृतियों से मेल खाती है, प्रत्येक एक अलग मार्ग संख्या से। दो-पूंछ वाले टी-परीक्षणों के अनुसार महत्वपूर्ण अंतर इंगित किए जाते हैं (* पी < 0.05)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: आगे और रिवर्स पाली और सह अभिकर्मक तकनीक की तुलना माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के तीन रिपोर्टर अभिकर्मक. कोशिकाओं को धनायनित लिपिड-आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक के 1 माइक्रोन और डीएनए के 500 एनजी (जीएफपी, आरएफपी और बीएफपी अभिव्यक्ति वैक्टर के 167 एनजी) के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए इलाज किया गया था। 48 घंटे बाद की कोशिकाओं का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से किया गया। (ए) विश्लेषण किए गए सभी कोशिकाओं का अनुपात जो सभी तीन पत्रकारों के लिए सकारात्मक थे। रिपोर्टर-पॉजिटिव कोशिकाओं को मिश्रित आबादी में प्रत्येक उपचार में गैर-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान करने के अलावा गैर-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के खिलाफ गेटिंग द्वारा निर्धारित किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ माध्य और 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। डेटा 3 स्वतंत्र प्रतिकृतियों से मेल खाती है, प्रत्येक एक अलग मार्ग संख्या से। दो-पूंछ वाले टी-परीक्षणों के अनुसार महत्वपूर्ण अंतर इंगित किए जाते हैं (* पी < 0.05)। (बी) ट्रिपल-पॉजिटिव आबादी के भीतर रिपोर्टर अभिव्यक्ति का वितरण। बीएफपी और आरएफपी संकेतों का विश्लेषण प्रत्येक दिए गए सेल के लिए जीएफपी संकेतों के लिए सामान्यीकृत किया गया था, फिर प्रति सेल डीएनए वेक्टर के अनुपात की कल्पना करने के लिए प्रति स्थिति प्लॉट किया गया था। प्लॉट डिस्ट्रिट्यूशन को एक छद्म रंग भूखंड के रूप में रंगा गया था, जो किसी दिए गए स्थान पर कोशिकाओं के घनत्व पर निर्भर था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: अंशांकन वक्र। मानक अंशांकन वक्र बराबर फ्लोरेसिन (एमईएफएल) के अणुओं के लिए जीएफपी चैनल (B525_FITC_A) में मनमाना फ्लोरोसेंट इकाइयों को सामान्य करने के लिए उपयोग किया जाता है। मानक घटता और सामान्यीकरण उत्पन्न और एक प्रवाह साइटोमेट्री डेटा विश्लेषक का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: एक एकल मार्कर के लिए प्रतिशत-सकारात्मक निर्धारित करने के लिए उदाहरण गेटिंग रणनीति। सेल प्लॉट पहले कोशिकाओं के लिए (एफएससी-ए बनाम) के माध्यम से गेटेड होते हैं। एसएससी-ए) और फिर कोशिकाओं को डबल्स (एफएससी-डब्ल्यू बनाम। एफएससी-एच)। प्रतिशत सकारात्मक द्वार एक गैर-ट्रांसफ़ेक्ट आबादी का उपयोग करके उत्पन्न होते हैं और इस तरह से गेटिंग करते हैं कि इस आबादी का 1% गेट के भीतर है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त डीएनए/प्लास्मिड के अनुक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

अभिकर्मक प्रोटोकॉल के व्यापक रूप से अपनाने के लिए एक प्रमुख कारण उनकी प्रजनन क्षमता और पहुंच है; हालांकि, इन प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक संदर्भों भर में अनुकूलन की आवश्यकता है. ऊपर उल्लेख नहीं मानक परीक्षण पहली बार के लिए एक नई सेल लाइन ट्रांसफ़ेक्ट करने का प्रयास करते समय आवश्यक है. सबसे पहले, अभिकर्मक अभिकर्मक की पसंद महत्वपूर्ण है, क्योंकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक एक आकार-फिट-सभी नहीं हैं और सेल प्रकारों में एनए वितरण व्यवहार्यता की दक्षता में भिन्न होंगे। इसके अतिरिक्त, एनए और अभिकर्मक अभिकर्मक की आदर्श मात्रा, साथ ही साथ उनके इष्टतम अनुपात को खोजने के लिए परीक्षण की आवश्यकता होती है। अक्सर अभिकर्मक अभिकर्मक आपूर्तिकर्ता-अनुशंसित अनुकूलन चरणों का पालन करना एनए और अभिकर्मक अभिकर्मक दोनों की आदर्श मात्रा में पहुंचने के लिए पर्याप्त है।

जब किसी दिए गए अभिकर्मक विफल हो गया है, तो पहला विचार उपयोग किए गए अभिकर्मकों की उपयुक्तता होनी चाहिए: विचार करें कि क्या एनए मान्य और अनुक्रमित है, चाहे कोशिकाएं अभिकर्मक से पहले एक बेहतर व्यवहार्य स्थिति में हों, चाहे अभिकर्मक अभिकर्मक का बहुत परीक्षण किया गया हो या अन्य अधिक सेल-विशिष्ट अभिकर्मकों की तुलना में। अक्सर बार एक महत्वपूर्ण नियंत्रण एक परीक्षण और मान्य प्रमोटर के नियंत्रण में जीएफपी व्यक्त एक वेक्टर का समावेश है, क्योंकि प्रमोटरों को अक्सर सेल-विशिष्ट माना जाता है, विभिन्न सेल लाइनों14 में अलग-अलग ताकत के साथ। उपयोगकर्ता तकनीकी त्रुटि के बाहर, एक बार एक दिया अभिकर्मक प्रोटोकॉल और एनए अनुकूलित किया गया है, प्रयोगात्मक परिणामों में बड़े विचलन अक्सर एक दिया अभिकर्मक के साथ मुद्दों का पता लगाया जा सकता है.

जबकि पाली अभिकर्मक का उपयोग एकल पॉट प्रयोगों है कि पारंपरिक सह अभिकर्मक के साथ अव्यवहार्य हैं के कई प्रकार सक्षम बनाता है, यह हमेशा स्पष्ट सबसे अच्छा विकल्प नहीं है. ऐसे मामलों में जहां कई एनए के अनुपात को अनुमापित किया जाना चाहिए, या जहां एक एनए की उपस्थिति दूसरों को खुराक पर निर्भर तरीके से प्रभावित करेगी, पॉली-अभिकर्मक एनए 8,9 के साथ तेजी से डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट चक्र आयोजित करना संभव बनाता है। दूसरी ओर, पाली अभिकर्मक अच्छी तरह से अनुप्रयोग जहां एकल कोशिका विश्लेषण, इस तरह के प्रवाह साइटोमेट्री के रूप में, प्रदर्शन नहीं किया जा रहा है के लिए अनुकूल नहीं हैं. इन मामलों में, एक समरूप आबादी का उत्पादन करने के लिए एक सह अभिकर्मक दृष्टिकोण और अधिक वांछनीय हो सकता है. इसके अतिरिक्त, अनुकूलन की परवाह किए बिना ट्रांसफ़ेक्ट करने के लिए कठिन हैं कि कोशिकाओं के लिए, पाली अभिकर्मक भारी प्रयोग स्केलिंग के बिना बहाव विश्लेषण के लिए पूरे वितरण भर में कोशिकाओं की एक उपयुक्त संख्या उपज नहीं हो सकता है.

अंत में, कुछ सेल लाइनों अभिकर्मक या अनुकूलन की परवाह किए बिना, अभिकर्मक बर्दाश्त नहीं करते. दुर्भाग्य से, ऐसी लाइनों पर रिपोर्ट आमतौर पर प्रकाशित नहीं होती है, जो किसी व्यक्तिगत लाइन की ट्रांसफेक्टबिलिटी पर जानकारी को सीमित करती है। ऐसे मामलों में, अन्य एनए वितरण विधियों की आवश्यकता हो सकती है, जैसे इलेक्ट्रोपोरेशन या वायरस-मध्यस्थता डिलीवरी। जब संभव हो, तथापि, इस तरह के रिवर्स पाली अभिकर्मक तकनीक के रूप में ऊपर वर्णित के रूप में विस्तारित अभिकर्मक प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं के लिए एक नया शासन खोलने, समय परीक्षण अभिकर्मकों और प्रोटोकॉल पर निर्माण.

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की रिपोर्ट नहीं करते हैं।

Acknowledgments

लेखक इस क्षेत्र में कई योगदानों को स्वीकार करना चाहेंगे जिन्हें अंतरिक्ष सीमाओं के कारण इस काम में उद्धृत नहीं किया गया था, साथ ही साथ इस अवसर को प्रदान करने वाली फंडिंग एजेंसियां भी। लेखक कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (सीआईएचआर) से वित्त पोषण स्वीकार करते हैं, जिन्होंने इस काम का समर्थन किया। केएम एनएसईआरसी से सीजीएस-एम छात्रवृत्ति और ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय से किलम डॉक्टरेट छात्रवृत्ति के प्राप्तकर्ता हैं। एनएस माइकल स्मिथ हेल्थ रिसर्च बीसी स्कॉलर अवार्ड के प्राप्तकर्ता हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase  MilliporeSigma SCR005
Apotransferrin  MilliporeSigma T1147-500MG
B27 supplement  ThermoFisher Scientific  17504044
Beta-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific  21985023
BSA fraction V (7.5%) Gibco 15260-037
CHIR99021  MilliporeSigma SML1046-25MG
DMEM-F12 MilliporeSigma D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads Spherotech URCP-38-2K
Gelatin  MilliporeSigma G1890
GlutaMAX supplement  ThermoFisher Scientific  35050061
Insulin  Gibco 12585-0014
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11668-019 Transfection reagent
Neurobasal media ThermoFisher Scientific  21103049
OptiMEM  Invitrogen 31985-070
PD0325901  MilliporeSigma PZ0162-25MG
Progesterone MilliporeSigma P8783 Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine MilliporeSigma P6780 Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF  BioTechne 8878-LF-500/CF
Sodium selenite  MilliporeSigma S5261-25G Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA ThermoFisher Scientific  25200056

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References

  1. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
  2. Fus-Kujawa, A., et al. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).
  3. FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  4. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. PLoS One. 8 (12), 81156 (2013).
  5. Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. K. The many faces of pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states. BMC Developmental Biology. 17 (1), (2017).
  6. Mulas, C., et al. Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells. Development. 146 (6), Cambridge, England. 173146 (2019).
  7. Tamm, C., Kadekar, S., Pijuan-Galitó, S., Annerén, C. Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 584-591 (2016).
  8. Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. PeerJ. 9, 11165 (2021).
  9. Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A "poly-transfection" method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
  10. Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
  11. Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. Rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection. Journal of Visualized Experiments. (192), e64793 (2023).
  12. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
  13. Teague, B. Cytoflow: A python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2023).
  14. Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PLoS One. 5 (5), 0010611 (2010).

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Maheden, K., Hwang, K., Egilmez, I., Shakiba, N. An Optimized Mouse Embryonic Stem Cell Based Reverse Poly-Transfection Technique for Rapid Exploration of Nucleic Acid Ratios. J. Vis. Exp. (202), e65766, doi:10.3791/65766 (2023).

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