Summary
Mevcut protokol, 2i ve LIF ortamı ile kültür sırasında fare embriyonik kök hücrelerinin ters poli-transfeksiyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem, geleneksel ileri transfeksiyon protokollerinden daha yüksek canlılık ve verimlilik sağlarken, aynı zamanda plazmit oranlarının tek kap optimizasyonunu da sağlar.
Abstract
Göreceli basitliği ve kullanım kolaylığı nedeniyle, memeli hücre hatlarının nükleik asitlerle geçici transfeksiyonu, biyomedikal araştırmalarda bir dayanak noktası haline gelmiştir. Yaygın olarak kullanılan hücre hatlarının çoğu, yapışık iki boyutlu kültürde transfeksiyon için sağlam protokollere sahip olsa da, bu protokoller genellikle daha az çalışılmış hatlara veya atipik, transfekte edilmesi zor morfolojilere sahip olanlara iyi tercüme edilmez. Rejeneratif tıp için yaygın olarak kullanılan bir kültür modeli olan 2i/LIF ortamında büyütülen fare pluripotent kök hücrelerini kullanan bu yöntem, daha yüksek transfeksiyon verimliliği elde edebilen optimize edilmiş, hızlı bir ters transfeksiyon protokolünü ana hatlarıyla belirtir. Bu protokolden yararlanarak, genişletilmiş bir plazmit stokiyometri aralığını incelemek için plazmit dağıtımındaki normalden daha yüksek verimlilikten yararlanılarak üç plazmit poli-transfeksiyonu gerçekleştirilir. Bu ters poli-transfeksiyon protokolü, kullanıcıların plazmit oranlarını birkaç ko-transfeksiyon yerine tek bir kuyuda optimize etmelerini sağlayan tek kap deneysel bir yönteme izin verir. DNA stokiyometrisinin iletilen genetik devrelerin genel işlevi üzerindeki etkisinin hızlı bir şekilde araştırılmasını kolaylaştırarak, bu protokol embriyonik kök hücre transfeksiyonunun süresini ve maliyetini en aza indirir.
Introduction
DNA ve RNA'nın memeli hücrelerine verilmesi, biyomedikal araştırmaların temel direği olarak hizmet eder1. Ekzojen nükleik asitleri (NA) memeli hücrelerine sokmak için yaygın bir yöntem, geçici transfeksiyon 2,3'tür. Bu teknik, NA'nın alıcı hücrelere iletebilen ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktifleri ile karıştırılmasına dayanır. Tipik olarak, NA, iki boyutlu bir yüzeye yapışan hücrelerin transfeksiyon kompleksini aldığı ileri transfeksiyon yoluyla iletilir. En yaygın olarak kurulan hücre hatları için ileri transfeksiyon sağlam ve protokoller iyi yayınlanmış olsa da, tek tabakalı olmayan morfolojilere sahip daha niş hücre tipleri kolayca transfekte olmaz, bu da verilebilecek NA miktarını ve onu alan hücre sayısını sınırlar.
Pluripotent kök hücreler (PSC'ler), süresiz olarak bölünme ve herhangi bir vücut hücresi tipi üretme yetenekleri göz önüne alındığında, gelişimi anlamak için çekici bir model ve rejeneratif tıp için bir araç olarak hizmet eder. Fare PSC'leri (mPSC'ler) için, 2 inhibitör ve LIF (2i/LIF) içeren rutin in vitro kültür koşulları, kubbe benzeri bir koloni morfolojisini koruyarak ileri transfeksiyona maruz kalan hücre sayısını doğrudan sınırlar 4,5,6. Bunu ele almak için, bir ters transfeksiyon gerçekleştirilebilir: hücreler, yapışkan hücrelere transfeksiyon reaktifi eklemek yerine, ortam ve transfeksiyon reaktifi içeren bir kabaeklenir 7. Bu, reaktife maruz kalan hücre sayısını artırırken, aynı zamanda hücrelerin aynı anda geçişini ve transfekte edilmesini gerektirir.
Basit tek NA transfeksiyonlarının ötesine geçerek, araştırmacılar genellikle birkaç NA yapısını in vitro bir hücre popülasyonuna iletmeyi amaçlarlar. Bu tipik olarak, NA'ların belirli bir oranda (1:1, 9:1, vb.) karıştırıldığı ve daha sonra seçilen transfeksiyon reaktifi8 ile birleştirildiği bir ko-transfeksiyon yoluyla elde edilir. Bu, NA'ların orijinal oranını koruyan bir NA ve reaktif karışımı verir - tedavideki hücreler bu karışımın farklı miktarlarını alabilirken, hepsi aynı oranıalır 9. İstenilen parça oranı bilindiğinde bu avantajlı olsa da, bu oranın önceden belirlenmesi emek yoğun olabilir ve her oran farklı bir koşul oluşturur. Bir alternatif, tek tek NA'ların transfeksiyon reaktifi ile birbirinden bağımsız olarak karıştırıldığı bir "poli-transfeksiyon" gerçekleştirmektir9. Araştırmacılar, tek tek NA'ları içeren transfeksiyon komplekslerini birleştirerek (kompleksleri oluşturmadan önce NA'ları birleştirmek yerine), tek bir transfeksiyon deneyinde çok çeşitli NA stokiyometrilerini keşfedebilirler9. Bu, indüklenebilir transkripsiyon sistemleri veya 1,10,11'de yerleşik geri beslemeli sistemler gibi birkaç NA'nın ürünlerinin birbiriyle etkileşime girmesinin beklendiği durumlarda özellikle değerlidir. Bununla birlikte, bunu etkili bir şekilde yapmak için yüksek bir transfeksiyon verimliliğine ihtiyaç vardır. Gerçekten de, benzersiz transfekte edilmiş NA'ların sayısı arttıkça, belirli bir hücrenin istenen tüm NA'ları alma olasılığı katlanarakazalır 9,12.
Aşağıdaki rapor, canlılığı en üst düzeye çıkarmak ve tipik kültür koşullarının dışındaki süreyi en aza indirmek için hücrelerin maksimum 5 dakika boyunca reaktif-NA karışımına maruz bırakıldığı katyonik lipid bazlı bir transfeksiyon reaktifi kullanan mPSC'ler için bir ters transfeksiyon protokolünü açıklamaktadır. Bu protokolün bu hücrelerin standart ileri transfeksiyonu ile karşılaştırılması, daha yüksek bir transfeksiyon verimliliği ve hayatta kalan transfekte edilmiş hücrelerin toplam sayısında bir artış olduğunu göstermektedir. Bu ters transfeksiyonu, basit floresan raportörleri içeren üç plazmit poli-transfeksiyon ile birleştirerek, NA oranlarını yüksek transfeksiyon verimliliği ile taramak için genişletilmiş bir potansiyel gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mPSC kültürü için reaktiflerin hazırlanması
- N2 takviyesi hazırlayın.
- Steril olmayan koşullarda, bir kimyasal güvenlik çeker ocakta aşağıdaki stok çözeltilerini (adım 1.1.1.1) hazırlayın. Her kimyasalın katı tozunu önceden tartılmış 50 mL'lik bir konik tüpe ekleyin. Tozu ekledikten sonra her bir tüpü tartın ve aşağıdaki konsantrasyonları elde etmek için uygun miktarda çözücü ekleyin. Bir parti medya için, listelenen minimum miktarı hazırlayın.
NOT: Aşağıdaki reaktifler tehlikelidir ve yerel kimyasal güvenlik yönergelerine uygun olarak kullanılmalıdır. Kullanım sırasında uygun KKD'yi sağlayın ve solunmasını önlemek için yalnızca bu kimyasalların katı toz formlarıyla kimyasal çeker ocakta çalışın.- 0.518 mg / mL'de suda minimum 0.05 mL sodyum selenit, 160 mg / mL'de suda 0.5 mL putresin, 0.6 mg / mL'de% 100 etanolde 0.165 mL progesteron (bkz.
- Solüsyonları -20 °C'de 2 yıla kadar saklayın.
- Bir biyogüvenlik kabininde (BSC), 58.035 mL DMEM-F12'ye aşağıdakileri ekleyin.
- 0.05 mL 0.518 mg / mL sodyum selenit çözeltisi, 0.5 mL 160 mg / mL putresin çözeltisi, 0.165 mL 0.6 mg / mL progesteron çözeltisi.
- Filtre, yukarıdaki karışımı 0.22 μm'lik bir filtre ile sterilize eder.
- Hala BSC'de, 100 mg / mL'lik bir apotransferrin çözeltisi hazırlayın.
- 500 mg apotransferrine 5 mL DMEM-F12 ekleyin (bkz. Kabarcıklardan kaçınarak kabı yavaşça yeniden askıya alın ve yıkayın.
- 5 mL ile mümkün olduğunca yeniden süspanse ettikten ve çıkardıktan sonra, selenit / putresin / progesteron çözeltisine ekleyin. Önceki solüsyondan daha fazlasını alın ve apotransferrin şişesini yıkayın, mümkün olduğunca fazlasını çıkarın.
- Çözeltiye 5 mL %7.5 BSA fraksiyonu V ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Tüp başına 6.875 mL'yi karıştırın ve alikotlayın. Alikotları -80 °C'de 1 yıla kadar saklayın.
- N2B27 ortamı yapmak için yukarıdaki N2 alikotlarını kullanırken, istenen alikotu çözün ve 10 mL 100x N2 için 6.875 N2'ye 3.125 mL 4 mg / mL insülin çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
- Steril olmayan koşullarda, bir kimyasal güvenlik çeker ocakta aşağıdaki stok çözeltilerini (adım 1.1.1.1) hazırlayın. Her kimyasalın katı tozunu önceden tartılmış 50 mL'lik bir konik tüpe ekleyin. Tozu ekledikten sonra her bir tüpü tartın ve aşağıdaki konsantrasyonları elde etmek için uygun miktarda çözücü ekleyin. Bir parti medya için, listelenen minimum miktarı hazırlayın.
- N2B27 bazal ortamını hazırlayın.
- N2 ve B27 takviyelerini 4 °C'lik bir buzdolabında birkaç saat veya gece boyunca çözdürün.
- Bir BSC'de, steril 1 L'lik bir şişede 484.5 mL DMEM-F12 ve 484.5 mL Nörobazal ortamı ( Malzeme Tablosuna bakınız) karıştırın.
- Ortama 10 mL B27 ve 10 mL N2 takviyesi ekleyin.
- 1 mL 55 mM beta-merkaptoetanol ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). 10 mL 100x glutamax ekleyin. Şişeyi döndürerek kuvvetlice karıştırın.
- Alikot başına istenen hacmi (tipik olarak 100 mL) ayırın ve -80 ° C'de 1 yıla kadar saklayın. 4 °C'de çözdürüldükten sonra 3 haftaya kadar kullanımda saklayın.
- NBiL ortamını hazırlayın.
- 100 ° C'lik buzdolabında -80 ° C'den 27 mL'lik bir N4B4 bazal ortam alikotunu çözdürün.
- Bir BSC'de, 10 μg/L'lik bir nihai konsantrasyona LIF ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
- CHIR99021 (3 μM final) ve PD0325901 (1 μM final) ekleyin (bkz. 50 mL'lik bir serolojik pipetle iyice karıştırın. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
- % 0.2 jelatin çözeltisi hazırlayın.
- 500 mL çift damıtılmışH2O'yu1 L'lik bir cam şişeye aktarın.
- 1 g jelatin ölçün ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve suya ekleyin. Çoğunlukla eriyene kadar şişeyi sallayarak karıştırın.
- Jelatin ve su karışımını 15 psi, 121 °C'de 35 dakika otoklavlayın. Soğuduktan sonra, filtre bir BSC'de 0,22 μm'lik bir filtre ile sterilize edin. 4 °C'de saklayın.
- Yıkama ortamı hazırlayın.
- Bir BSC'de, 10 mL DMEM-F12 başına 160 μL %7.5 BSA karıştırın.
- Yukarıdakileri ölçeklendirin ve ileride kullanım kolaylığı için büyük miktarlarda hazırlayın (örneğin, 8 mL %7,5 BSA ila 500 mL DMEM-F12). 4 °C'de saklayın.
2. mPSC poli-transfeksiyonu için reaktiflerin hazırlanması
NOT: Aşağıdaki değerler, 24 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğu için sağlanmıştır. Değerler buna göre ölçeklendirilebilir. Tüm DNA/plazmitlerin dizileri Ek Dosya 1'de detaylandırılmıştır.
- Tedavi başına gereken DNA çözeltisinin hacmini hesaplayın.
- Kuyu / koşul başına 500 ng DNA hazırlayın.
- Tek bir plazmiti 100 ng/μL'lik bir DNA çözeltisi ile transfekte ediyorsanız, 5 μL DNA içeren bir tüp hazırlayın.
- Her biri 100 ng/μL'de iki plazmiti transfekte ediyorsanız, her plazmit için bir tane olmak üzere her birinde 2.5 μL olan iki tüp hazırlayın.
- Kuyu / koşul başına 500 ng DNA hazırlayın.
- Bir BSC'de aşağıdakileri gerçekleştirin: Her 500 ng transfeksiyon işlemi için (Malzeme Tablosuna bakınız), 25 μL OptiMEM'i 1.5 mL'lik bir tüpe ayırın.
- Bunu buna göre ölçeklendirin - yukarıdaki örnek için, her biri 250 ng DNA (2,5 μL) ve 12,5 μL OptiMEM içeren iki tüp hazırlayın.
- Bu tedavi için gerekli DNA hacmini tüpteki OptiMEM'e ekleyin.
- 500 ng DNA ve OptiMEM'e sahip her tüp için, başka bir 25 μL OptiMEM ve 1 μL katyonik lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ile eşleşen bir tüp oluşturun.
- Yine, bu değerler buna göre ölçeklendirilmelidir. Yukarıdaki örnek için, her biri 12,5 μL OptiMEM ve 0,5 μL transfeksiyon reaktifi içeren iki tüp hazırlayın.
NOT: Değerleri ölçeklendirirken, o DNA miktarı için gereken hacmi değil, eklenen DNA kütlesini kullanın. Transfeksiyon reaktifi ve DNA ile reaksiyonlar ölçeklendirilebilir (örneğin, aynı DNA ile 5 kuyu transfekte edilecekse). Reaktiflerin oranlarını aynı tutun, ancak buna göre ölçeklendirin (örneğin, 1000 ng DNA: 50 μL OptiMEM: 2 μL transfeksiyon reaktifi: 50 μL OptiMEM).
- Yine, bu değerler buna göre ölçeklendirilmelidir. Yukarıdaki örnek için, her biri 12,5 μL OptiMEM ve 0,5 μL transfeksiyon reaktifi içeren iki tüp hazırlayın.
3. Transfeksiyon için mPSC'lerin hazırlanması
NOT: Ters transfeksiyon için, transfeksiyon reaktiflerini eklemeden önce kültür kabını hazırlayın ve mPSC'leri doğrudan geçirin. İleri transfeksiyon için, hücrelerin plakaya yapışmasını sağlamak için transfeksiyondan 12-18 saat önce hücreleri geçirin ve plakalayın.
- % 0.2 jelatin kaplı bir hücre kültürü kabı hazırlayın.
- Transfeksiyon için gereken kuyu sayısını planlayın (tedavi/grup başına 24 oyuklu bir plakadan bir kuyu).
- 24 oyuklu plakada istenen oyukların her birine 200 μL% 0.2 jelatin çözeltisi ekleyin.
- Çözeltiyi eşit şekilde yaymak için plakayı hafifçe sallayın ve kuyunun tüm tabanını kapladığından emin olun.
- Kuyucukların oda sıcaklığında en az 15 dakika kaplanmasına izin verin.
- Bir vakum aspiratörü kullanarak, kalan jelatini kuyulardan dikkatlice çıkarın (jelatin tabakasını kazımadan tüm sıvının çıkarılmasını sağlamak için plakayı eğin).
- Her bir oyuğa 0.5 mL NBiL ortamı (adım 1.3) ekleyin ve plakayı ön ısıtmak için bir doku kültürü inkübatöründe bırakın.
- Geçiş mPSC'leri.
- 30 mL yıkama ortamını (adım 1.5) 50 mL'lik konik bir tüpe ekleyin.
- Eski besiyerini mESC'lerin doku kültürü kabından aspire edin.
NOT: Çeşitli aspirasyon tekniklerine izin verilir. Hangi teknik seçilirse seçilsin, hücrelerin uzun süre kuru kalmadığından emin olun (maksimum yaklaşık 30 saniye). - Piyasada bulunan gerekli miktarda hücre detatchment ortamı ekleyin (10 cm'lik bir tabak için 1,5 mL, buna göre ölçeklendirin, bkz.
- Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için P1000 pipetle 15-20 kez yukarı ve aşağı pipetlemeden önce 3-5 dakika bekleyin. Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için hücreleri mikroskop altında görüntüleyin.
- Boşaltma ortamındaki hücreleri, yıkama ortamı içeren 50 mL'lik tüpe aktarın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Yıkama ortamını aspire edin, tüpte artık sıvı kalmamasını sağlayın.
- Peletin az miktarda yıkama ortamında (~300 μL) yeniden süspanse edilmesi. Hücre yoğunluğunu elde etmek için bir hemositometre kullanarak hücre süspansiyonunu sayın.
4. mPSC'lerin ters transfeksiyonu
- Poli-transfeksiyon reaktiflerini 2. adıma göre hazırlayın.
- Hücre kültürü kabını ve geçiş mPSC'lerini adım 3'e göre hazırlayın.
- Her tedavi için bir tane olmak üzere 1.5 mL'lik tüplere 200 μL NBiL ortamı ekleyin.
- DNA:OptiMEM karışımına 26 μL OptiMEM:transfeksiyon reaktif karışımı ekleyin. Reaktifleri yaklaşık 10 kez pipetleyerek hızlı ve kuvvetli bir şekilde karıştırın. Karışımın oda sıcaklığında 5 dakika inkübe etmesine izin verin.
- Hücre yoğunluğuna bağlı olarak, tüp başına 25.000 hücre elde etmek için gerekli hücre hacmini 300 μL hücre süspansiyonundan 200 μL NBiL tüplerine aktarın.
- Lipofectamine 2000 (L2K, transfeksiyon reaktifi) ve DNA karışımının 5 dakika inkübasyonundan sonra, 1.5 mL'lik hücre tüpüne ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Hücrelerin oda sıcaklığında 5 dakika boyunca reaktifle inkübe etmesine izin verin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Sıvıyı yaklaşık 50 μL bırakarak pipetleyin.
- Hücre peletini 100 μL NBiL ortamı ile yeniden süspanse edin. Hücreleri plakaya aktarın ve plakayı inkübatöre yerleştirin. Medyayı 24 saat sonra yeni NBiL medyası ile değiştirin.
5. mPSC'lerin ileri transfeksiyonu
- Transfeksiyondan 12-18 saat önce, hücre kültürü kabını hazırlayın ve mPSC'leri adım 3'e göre pasajlayın.
- Hücre yoğunluğuna bağlı olarak, 300 μL hücre karışımından gerekli hücre hacmini oyuk başına 25.000 hücreye aktarın. Plakayı inkübatöre yerleştirin.
- Transfeksiyondan 1 saat önce, ortamı tüm kuyucuklardan aspire edin ve 0,5 mL NBiL ortamı ile değiştirin. Plakayı inkübatöre yerleştirin.
- Transfeksiyon sırasında, mPSC poli-transfeksiyon reaktiflerini adım 2'ye göre hazırlayın.
- DNA:OptiMEM karışımına 26 μL OptiMEM:transfeksiyon reaktif karışımı ekleyin. Reaktifleri yaklaşık 10 kez pipetleyerek hızlı ve kuvvetli bir şekilde karıştırın. Kombine karışımın oda sıcaklığında 5 dakika inkübe etmesine izin verin.
- Kombine karışımı damla damla kuyucuklara ekleyin. Plakayı inkübatöre yerleştirin. Medyayı 24 saat sonra değiştirin.
6. Akış sitometrisi
- Ortamı, transfeksiyondan 48 saat sonra transfekte edilmiş 24 oyuklu plakadan aspire edin.
- Her oyuğa 200 μL tripsin ekleyin, döndürün ve 37 ° C'de 30 saniye inkübe edin. Plakanın kenarlarına hafifçe vurun ve 200 μL buz gibi soğuk FACS tamponu (PBS'de %2 FBS) ekleyin.
- A96'den başlayarak V tabanlı 1 oyuklu bir plakayı açın ve etiketleyin. Hücreleri yerinden çıkarmak ve bir P200 pipeti ile tek hücreli çözeltiler yapmak için her bir oyuğun içeriğini transfekte edilmiş plaka üzerinde karıştırın. Her kuyucuktan 200 μL'yi 96 oyuklu plaka üzerindeki uygun kuyuya aktarın.
- 50 mL'lik bir reaktif rezervuarına 15 mL FACS tamponu ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. 96 oyuklu plakayı hızlı ve yumuşak bir hareketle lavaboya ters çevirerek süpernatanı atın.
- Reaktif haznesinden 150 μL FACS tamponunda 96 oyuklu plaka üzerindeki peletleri yeniden süspanse etmek için çok kanallı bir pipet kullanın. 6.4-6.5 arasındaki adımları iki kez tekrarlayın. 96 oyuklu plakayı ışıktan korunan buz dolu bir kutuya yerleştirin.
- Floresan raportörlerin popülasyon dağılımlarını elde etmek için örnekleri bir akış sitometresinden geçirin.
- Sitometrenin gerçekleştirilecek deney için lazer ve filtre kombinasyonları açısından uygun olduğundan emin olun (örneğin, uzak kırmızı spektrumda uyarmak veya tespit etmek mümkün değilse kızılötesi raportör kullanmayın).
- Analiz sırasında verilerin MEFL dönüşümüne izin vermek için standardizasyon boncukları için ek numuneler ekleyin. Uygun istatistiksel analiz için numune başına yeterli hücrenin toplandığından emin olun9.
- Ham sitometre dosyalarından floresan birimleri dönüştürün ve Python veya MATLAB tabanlı boru hatları veya ticari olarak temin edilebilen yazılımlar 9,13 gibi çeşitli yöntemlerden herhangi birini kullanarak verileri analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hem ileri hem de geri transfeksiyonlar, hücre zarı ile gelen transfeksiyon reaktifi-DNA kompleksleri arasındaki etkileşime dayanır ve NA'nın alıcı hücrelere iletilmesine izin verir. Bu tekniklerin farklı olduğu yer, hücrenin doğumdaki durumudur - DNA tipik olarak geleneksel ileri transfeksiyonda yapışık hücre tek katmanlarına iletilirken, ters transfeksiyon bunun yerine reaktif-DNA kompleksinin tek hücreli bir süspansiyon içindeyken hücrelerle buluşmasına dayanır. Bu fark, hücrelerin tekdüze, düz bir tek tabaka olarak büyümediği ve bunun yerine mPSC'lerde olduğu gibi daha kubbeli veya koloni benzeri bir morfoloji benimsediği durumlarda özellikle önemli olabilir. Birlikte transfeksiyon yerine poli-transfeksiyon gerçekleştirmek gibi geleneksel transfeksiyon üzerinde ek varyasyonlar benimsenebilir. Bu modifikasyon, belirli bir tedavide her bir DNA türünün nispi dağılımlarını değiştirerek, araştırmacıların fenotip ile plazmitlerinin dozu arasındaki ilişkiyi hızlı bir şekilde keşfetmelerine olanak tanır. Bu deneyleri gerçekleştirirken, sitometrenin kendisinin standardizasyonunu ve kalite kontrolünü yapmak da çok önemlidir. Aşağıdaki deneylerin birçoğu için floresan üniteleri, belirlenen protokolleregöre deney günleri arasında doğru karşılaştırmaya izin vermek için bir floresan boncuk standardına normalleştirilmiştir (Ek Şekil 13). Hücreler gösterildiği gibi manuel olarak kapılandı (Ek Şekil 2).
mPSC'lerin koloni morfolojisi göz önüne alındığında, geleneksel ileri transfeksiyon yöntemleri, doğrudan çevreleyen ortama maruz kalan hücre sayısı ile sınırlı olacaktır. Ters transfeksiyonlarla karşılaştırıldığında, ileri transfeksiyonlar, hücre popülasyonuna ortalama olarak önemli ölçüde daha düşük miktarda DNA verilmesine rağmen (>3 kat daha az, p < 0.05, Şekil 1A) önemli ölçüde daha düşük bir hücre oranına sahipti (~ 1.3 kat, Şekil 1B).
İlginç bir şekilde, inkübasyon süresi, raportör için pozitif olan hücrelerin oranını önemli ölçüde etkiledi, ancak pozitif hücrelerdeki ortalama raportör ekspresyonunu etkilemedi (Şekil 2A, B). Hücrelerin 20 dakikaya kadar inkübe edilmesinin, raportör için pozitif hücrelerin yüzdesini arttırdığı ve 40 dakikadan daha uzun sürenin bu yüzdeyi azalttığı görüldü. Kritik olarak, reaktifi doğrudan pasajlı hücrelerle kuyuya ekleyerek ters transfeksiyonu gerçekleştirirken, en yüksek %-pozitif ve ortalama ekspresyon seviyelerini verirken, aynı zamanda seçilen son noktada daha az sayıda hayatta kalan hücre ile sonuçlandı. Bu protokol için önerilen 5 dakikanın ötesinde inkübe edildiğinde transfeksiyon verimliliğinde bir artış görülebilirken, uzun süreli pertürbasyonun kök hücre durumu ve farklılaşma kabiliyeti için sonuçları olabileceğinden dikkatli olunması önerilir6. Poli- ve ko-ters ve ileri transfeksiyonların transfeksiyonu takiben hücrelerin genel büyümesi üzerindeki etkisini açıklığa kavuşturmak için, transfeksiyondan 48 saat sonra hücre sayımı yaptık (Şekil 3). Hem poli hem de ko-transfeksiyon için, ileri transfeksiyon gerçekleştirmek, ters transfeksiyonlara kıyasla seçilen son noktada bulunan hücre sayısını önemli ölçüde azalttı. Ters veya ileri transfeksiyonlar içinde poli- ve ko-transfeksiyon arasında karşılaştırma yapıldığında anlamlı bir fark gözlenmedi.
İleri ve geri poli-transfeksiyon karşılaştırıldığında, ters transfeksiyon durumunda gözlemlenebilir şekilde daha yüksek bir transfeksiyon verimliliği vardır (Şekil 4A). Hücrelere iletilen üç floresan raportör ile, ileri transfeksiyonlardan kaynaklanan üçlü pozitif hücrelerin sayısı, ters tedavilerde görülenlerden önemli ölçüde daha düşüktür. Transfeksiyon verimliliğindeki farkın sonucu, poli-transfekte edilmiş popülasyonlar için ortaya çıkan dağılımlarda da görülebilir (Şekil 4B). Her ikisi tarafından keşfedilen toplam oran aralığı kabaca aynı olsa da, ileri poli-transfeksiyon durumunda dağılım boyunca toplam hücre sayısı eksiktir. Bu koşulları birlikte transfeksiyonlarla karşılaştırırken, verilen DNA oranlarında bir fark görülebilir: ko-transfeksiyon tipik olarak yaklaşık 1:1:1'lik bir teslimatla sonuçlanırken, poli-transfeksiyon muhabirleri birkaç kütük katlama aralığında iletir.
Ters poli-transfeksiyon için DNA oranlarının genel dağılımını gözlemlerken, artan verimliliğin avantajı takdir edilebilir (Şekil 4B). Hem ileri hem de geri transfeksiyon, DNA'nın gerçek karışık oranına (1:1:1) yakın oranların iyi bir temsilini verirken, ters durum, iyi temsil edilen genişletilmiş bir dinamik oran aralığına sahiptir.
Şekil 1: Fare embriyonik kök hücrelerinde ileri ve geri transfeksiyonlar arasındaki transfeksiyon verimliliğinin karşılaştırılması. Ters transfekte edilmiş hücreler, tek bir yıkama ve kaplamadan önce 5 dakika boyunca GFP vektör-transfeksiyon reaktif kompleksleri ile muamele edildi. Verimlilik, transfeksiyondan 48 saat sonra akış sitometrisi ile ölçüldü. 25.000 hücre, tüm koşullar için 1 μL katyonik lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ve 500 ng DNA ile muamele edildi. (A) Ters veya ileri transfeksiyon yoluyla transfekte edilen hücreler için yüzde pozitifin karşılaştırılması. GFP pozitif hücreler, karışık popülasyondaki her tedavide transfekte edilmemiş hücrelerin belirlenmesine ek olarak, transfekte edilmemiş hücrelere karşı geçit yapılarak belirlendi. (B) İleri veya geri transfeksiyon yoluyla GFP için pozitif transfekte edilen hücre popülasyonlarının ortalama floresan yoğunluğunun karşılaştırılması. Hata çubukları ortalama ve 1 standart sapmayı temsil eder. Veriler, her biri farklı bir geçiş numarasından 3 bağımsız kopyaya karşılık gelir. İki kuyruklu t-testine göre anlamlı farklılıklar belirtilmiştir (*p < 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir GFP vektörünün fare embriyonik kök hücrelerine ters transfeksiyonları için inkübasyon süresinin titrasyonu. Hücreler, yıkanmadan ve kaplanmadan önce çeşitli sürelerde 1 μL katyonik lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ve 500 ng DNA ile karıştırıldı. Gece tedavileri, hücrelerin doğrudan transfeksiyon reaktifi-DNA kompleksleri içeren kuyucuklara kaplanmasından ve 18 saat sonra tedavi için bir ortam replasmanından oluşuyordu. GFP ekspresyonu akım sitometrisi ile ölçüldü. (A) Bir GFP vektörü için pozitif transfekte edilen hücrelerin ortalama floresan yoğunluğunun karşılaştırılması. (B) GFP vektör-katyonik lipid bazlı transfeksiyon reaktif kompleksleri ile çeşitli inkübasyon sürelerini takiben GFP raportörünü eksprese eden her tedavideki hücre yüzdesinin karşılaştırılması. GFP pozitif hücreler, karışık popülasyondaki her tedavide transfekte edilmemiş hücrelerin belirlenmesine ek olarak, transfekte edilmemiş hücrelere karşı geçit yapılarak belirlendi. Hata çubukları ortalama ve 1 standart sapmayı temsil eder. Veriler, her biri farklı bir geçiş numarasından 3 bağımsız kopyaya karşılık gelir. İki kuyruklu t-testine göre anlamlı farklılıklar belirtilmiştir (*p < 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Eş ve çoklu ters ve ileri transfeksiyonlar arasındaki bolluğun karşılaştırılması. Hücreler 500 ng vektör DNA ve 1 μL katyonik lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ile transfekte edildi ve 48 saat sonra hemositometre canlı hücre sayımı için hasat edildi. Hücre sayımları, transfekte edilmemiş kontrollere normalleştirildi. Hata çubukları ortalama ve 1 standart sapmayı temsil eder. Veriler, her biri farklı bir geçiş numarasından 3 bağımsız kopyaya karşılık gelir. İki kuyruklu t-testine göre anlamlı farklılıklar belirtilmiştir (*p < 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Fare embriyonik kök hücrelerinin ileri ve geri poli ve ko-transfeksiyon tekniklerini karşılaştıran üç raportör transfeksiyonu. Hücreler, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1 μL katyonik lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ve 500 ng DNA (GFP, RFP ve BFP ekspresyon vektörlerinin her biri 167 ng) ile muamele edildi. 48 saat sonra hücreler akım sitometrisi ile analiz edildi. (A) Analiz edilen ve her üç raportör için de pozitif olan tüm hücrelerin oranı. Raportör pozitif hücreler, karışık popülasyondaki her tedavide transfekte edilmemiş hücrelerin tanımlanmasına ek olarak, transfekte edilmemiş hücrelere karşı geçit yapılarak belirlendi. Hata çubukları ortalama ve 1 standart sapmayı temsil eder. Veriler, her biri farklı bir geçiş numarasından 3 bağımsız kopyaya karşılık gelir. İki kuyruklu t-testine göre anlamlı farklılıklar belirtilmiştir (*p < 0.05). (B) Raportör ifadesinin üçlü pozitif popülasyon içindeki dağılımı. BFP ve RFP sinyalleri, analiz edilen her bir hücre için GFP sinyallerine normalleştirildi, daha sonra hücre başına DNA vektörü oranlarını görselleştirmek için koşul başına çizildi. Arsa dağılımı, belirli bir uzaydaki hücrelerin yoğunluğuna bağlı olarak sahte renkli bir çizim olarak renklendirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Kalibrasyon eğrisi. GFP kanalındaki (B525_FITC_A) rastgele floresan birimlerini eşdeğer floresan moleküllerine (MEFL) normalleştirmek için kullanılan standart kalibrasyon eğrisi. Standart eğriler ve normalizasyon, bir akış sitometrisi veri analizörü kullanılarak oluşturuldu ve gerçekleştirildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Tek bir işaretleyici için yüzde pozitifi belirlemek için örnek geçit stratejisi. Hücre grafikleri ilk olarak hücreler için (FSC-A vs. SSC-A) ve daha sonra hücreler çiftler için kapılanır (FSC-W vs. FSC-H) olarak adlandırılır. Yüzde pozitif kapılar, transfekte edilmemiş bir popülasyon kullanılarak ve bu popülasyonun% 1'i kapının içinde olacak şekilde geçit oluşturularak oluşturulur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Bu çalışmada kullanılan DNA/plazmitlerin dizileri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transfeksiyon protokollerinin yaygın olarak benimsenmesinin temel nedeni, tekrarlanabilirlikleri ve erişilebilirlikleridir; Ancak, bu protokoller deneysel bağlamlarda optimizasyon gerektirir. Yukarıda bahsedilmeyen, yeni bir hücre hattını ilk kez kesmeye çalışırken gerekli olan standart testtir. İlk olarak, transfeksiyon reaktifi seçimi çok önemlidir, çünkü ticari olarak temin edilebilen reaktifler herkese uyan tek bir beden değildir ve hücre tipleri arasında NA iletim canlılığının verimliliğinde değişiklik gösterecektir. Ek olarak, ideal NA ve transfeksiyon reaktifi miktarının yanı sıra optimal oranlarını bulmak test gerektirir. Genellikle, transfeksiyon reaktifi tedarikçisi tarafından önerilen optimizasyon adımlarını takip etmek, hem NA hem de transfeksiyon reaktifinin ideal miktarına ulaşmak için yeterlidir.
Belirli bir transfeksiyon başarısız olduğunda, ilk husus kullanılan reaktiflerin uygunluğu olmalıdır: NA'nın doğrulanıp sıralanmadığını düşünün, hücrelerin transfeksiyondan önce optimal olarak yaşayabilir bir durumda olup olmadığını, transfeksiyon reaktifinin lot testine tabi tutulup tutulmadığını veya diğer daha hücreye özgü reaktiflerle karşılaştırılıp karşılaştırılmadığını düşünün. Çoğu zaman kritik bir kontrol, test edilmiş ve onaylanmış bir promotörün kontrolü altında GFP'yi eksprese eden bir vektörün dahil edilmesidir, çünkü promotörlerin genellikle farklı hücre hatlarında farklı güçlere sahip hücreye özgü olduğu bilinmektedir14. Kullanıcı teknik hatasının dışında, belirli bir transfeksiyon protokolü ve NA optimize edildikten sonra, deneysel sonuçlardaki büyük sapmalar genellikle belirli bir reaktifle ilgili sorunlara kadar izlenebilir.
Poli-transfeksiyon kullanımı, geleneksel ko-transfeksiyonlarla mümkün olmayan çeşitli tek kap deneylerine olanak tanırken, her zaman en iyi seçim değildir. Birkaç NA oranının titre edilmesi gereken veya bir NA'nın varlığının diğerlerini doza bağlı bir şekilde etkileyeceği durumlarda, poli-transfeksiyon, NA'lar 8,9 ile hızlı tasarım-yapı-test döngülerinin yürütülmesini mümkün kılar. Öte yandan, poli-transfeksiyonlar, akış sitometrisi gibi tek hücreli analizlerin yapılmadığı uygulamalar için uygun değildir. Bu durumlarda, homojen bir popülasyon üretmek için bir ko-transfeksiyon yaklaşımı daha arzu edilebilir. Ek olarak, optimizasyondan bağımsız olarak transfekte edilmesi zor olan hücreler için, poli-transfeksiyonlar, deneyi büyük ölçüde büyütmeden aşağı akış analizi için tüm dağılım boyunca uygun sayıda hücre vermeyebilir.
Son olarak, bazı hücre hatları, reaktif veya optimizasyondan bağımsız olarak transfeksiyonu tolere etmez. Ne yazık ki, bu tür hatlarla ilgili raporlar tipik olarak yayınlanmaz ve bu da tek bir hattın dönüştürülebilirliği hakkındaki bilgileri sınırlar. Bu gibi durumlarda, elektroporasyon veya virüs aracılı dağıtım gibi diğer NA dağıtım yöntemleri gerekebilir. Bununla birlikte, mümkün olduğunda, yukarıda tarif edildiği gibi ters poli-transfeksiyon teknikleri gibi genişletilmiş transfeksiyon protokolleri, araştırmacılar için zaman içinde test edilmiş reaktifler ve protokoller üzerine inşa edilen yeni bir rejim açar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.
Acknowledgments
Yazarlar, alan sınırlamaları nedeniyle bu çalışmada atıfta bulunulmayan alana yapılan birçok katkının yanı sıra bu fırsatı sağlayan finansman kuruluşlarına da teşekkür etmek istemektedir. Yazarlar, bu çalışmayı destekleyen Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nden (CIHR) fon aldığını kabul etmektedir. K.M., NSERC'den CGS-M bursu ve British Columbia Üniversitesi'nden Killam Doktora Bursu almıştır. N.S., Michael Smith Health Research BC Scholar Ödülü'nün sahibidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | MilliporeSigma | SCR005 | |
| Apotransferrin | MilliporeSigma | T1147-500MG | |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| Beta-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Gibco | 15260-037 | |
| CHIR99021 | MilliporeSigma | SML1046-25MG | |
| DMEM-F12 | MilliporeSigma | D6421-24X500ML | |
| Flow cytometry standardization beads | Spherotech | URCP-38-2K | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G1890 | |
| GlutaMAX supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin | Gibco | 12585-0014 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent |
| Neurobasal media | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| PD0325901 | MilliporeSigma | PZ0162-25MG | |
| Progesterone | MilliporeSigma | P8783 | Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Putrescine | MilliporeSigma | P6780 | Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Recombinant mLIF | BioTechne | 8878-LF-500/CF | |
| Sodium selenite | MilliporeSigma | S5261-25G | Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
References
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Fus-Kujawa, A., et al. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).
- FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. PLoS One. 8 (12), 81156 (2013).
- Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. K. The many faces of pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states. BMC Developmental Biology. 17 (1), (2017).
- Mulas, C., et al. Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells. Development. 146 (6), Cambridge, England. 173146 (2019).
- Tamm, C., Kadekar, S., Pijuan-Galitó, S., Annerén, C. Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 584-591 (2016).
- Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. PeerJ. 9, 11165 (2021).
- Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A "poly-transfection" method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
- Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
- Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. Rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection. Journal of Visualized Experiments. (192), e64793 (2023).
- Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
- Teague, B. Cytoflow: A python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2023).
- Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PLoS One. 5 (5), 0010611 (2010).
