Summary
このプロトコルは、高度なライトシート顕微鏡法と適応した組織透明化法を利用して、げっ歯類の心臓の複雑な心臓構造を調査し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。
Abstract
ライトシート顕微鏡(LSM)は、心臓の複雑な3次元(3D)構造を理解する上で極めて重要な役割を果たし、基本的な心臓生理学と病理学的反応に関する重要な洞察を提供します。ここでは、マウスモデルにおける心臓のマイクロアーキテクチャを解明するためのLSM技術の開発と実装を掘り下げます。この手法は、カスタマイズされたLSMシステムと組織透明化技術を統合し、体積イメージングのための心臓組織内の光散乱を軽減します。従来のLSMと画像スティッチングおよびマルチビューデコンボリューションアプローチを組み合わせることで、心臓全体をキャプチャできます。軸方向の分解能と視野(FOV)の間の固有のトレードオフに対処するために、焦点の合っていない光を最小限に抑え、伝搬方向全体で心臓を均一に照らす軸方向に掃引ライトシート顕微鏡(ASLM)法をさらに導入します。一方、iDISCOなどの組織透明化法は、光の透過性を高め、深部構造の可視化を容易にし、心臓全体の心筋を包括的に検査することができます。提案されたLSMと組織透明化法の組み合わせは、げっ歯類の心臓の心臓構造を解明する上で研究者にとって有望なプラットフォームを提供し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。
Introduction
心不全は、主に成熟した心筋細胞の再生能力の欠如により、世界中で依然として主要な死亡原因となっています1。心臓の複雑な構造は、その機能において重要な役割を果たし、発達過程への洞察を提供します。心筋梗塞に対する心臓の形態形成やリモデリングの根本的な過程を解明するためには、心臓の構造を深く理解することが不可欠です。近年の進歩により、新生児マウスは損傷後に心機能を回復できるが、成体マウスにはそのような再生能力がないことが示されている2。これにより、マウスモデルの構造的および機能的異常に関連する手がかりを調査するための基盤が確立されます。共焦点顕微鏡などの従来のイメージング方法には、透過深度の制限、低速な点走査方式、レーザー光への長時間の曝露による光損傷などの技術的な制限があります。これらは、無傷の心臓の包括的な3次元(3D)イメージングを妨げます。これに関連して、ライトシート顕微鏡(LSM)は強力なソリューションとして浮上し、高速イメージング、写真による損傷の低減、および卓越した光学セクショニング機能の利点を提供します3,4,5。LSMのユニークな特徴は、従来の技術の限界を克服するための有望な方法として位置付けられ、心臓の発生とリモデリングプロセスに関する前例のない洞察を提供します6,7,8。
このプロトコルでは、高度なLSMと適応した組織透明化アプローチ9を組み合わせたイメージング戦略を導入し、特定の標識や機械的切片化を必要とせずにマウス心臓全体のイメージングを可能にします。さらに、従来のLSMイメージングは、マルチビューデコンボリューション10または軸方向に掃引されたライトシート顕微鏡(ASLM)技術11,12,13,14,15によって強化され、軸方向の分解能を向上させることができることを提案する。さらに、これらの方法のいずれかと画像スティッチングを統合することで、空間分解能と視野(FOV)のトレードオフを効果的に克服し、成体マウスの心臓のイメージングを進歩させることができます。疎水性、親水性、およびハイドロゲルベースの方法を含む多数の組織透明化アプローチを組み込むことにより、心臓全体の形態を捕捉するためのより深い光透過が可能になります16,17,18,19。
現在のLSMシステムとは複数のクリアリング方法と互換性がありますが、目標は、脂質を屈折率に近い媒体に置き換えることにより、光子散乱を最小限に抑え、心臓などの組織への光の透過性を高めることです。iDISCOは代表20,21として選択され、その迅速な処理と高い透明性により、このプロトコルの自家蛍光イメージングに適合しました(図1A)。全体として、高度なLSMアプローチと組織除去技術の統合は、げっ歯類の心臓の複雑な心臓解剖学的構造を解明するための有望なフレームワークを提供し、心臓の形態形成と病因の理解を深めるための大きな可能性を秘めています。
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Protocol
動物実験は、テキサス大学ダラス校の動物管理・使用委員会(IACUC #21-03)の監督下で承認され、実施されています。この研究では、出生後1日目(P1)の新生児と8週齢の成人を含むC57BL6マウスを使用しました。雄と雌の間に差は観察されませんでした。すべてのデータ取得と画像後処理は、研究または教育ライセンスを取得したオープンソースソフトウェアまたはプラットフォームを使用して実行されました。リソースは、合理的な要求に応じて著者から入手できます。
1.サンプル調製と組織透明化(6〜10日)
- 組織透明化手順を開始する前に、組織透明化方法に必要なすべての化学溶液を材料 表 で調製してください。
注意: 特に有毒化学物質を取り扱う場合は、適切な個人用保護具を着用しながら、ドラフトですべての手順を実行してください。 - 動物をCO2 で安楽死させるには、P1や8週間などの所望の時点でCO2 チャンバーに入れて心臓全体を採取し、新たに分離した心臓を室温(RT)で0.2M KClに浸して拡張期16で停止します。
- 心臓の解剖学的構造を4°Cで保存するために、ロッカーで一晩穏やかに攪拌しながら、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を浸して心臓を固定します( 表1を参照)。
注意: PFAは有毒な化学物質であり、ドラフトの下で実行する必要があります。 - 室温で1x PBSで心臓を30分間、3回洗浄します。
注:オプション:心臓をアガロースゲルに埋め込み、以下に説明するように、ステップ2でカスタムビルドLSMシステム用の心臓アセンブリを作成します。- アガロースをPBSに溶解して1%アガロース溶液を調製し、混合物を完全に溶解するまで電子レンジで加熱します。溶液を型に流し込み、溶液が40°Cに冷えるまで最下層を作ります。
- 心臓を型に入れ、固まるまで型にアガロースゲルを充填します。アガロースゲル内の気泡を除去して、イメージングのアーチファクトを最小限に抑えます。
注:サンプルを埋め込むことで、取り付け中に心臓の解剖学的構造が損傷するリスクが軽減されます。
注意:低融点のアガロースを使用し、サンプルを高温にさらすリスクを軽減するために、心臓を加熱されたアガロースに直接置かないでください。
- メタノールと脱イオン水(図1B)を混合したグラジエントを用いて心臓を脱水し、 表1に概説されているように、20%、40%、60%、80%、80%、および100%の連続濃度で処理します。新鮮な100%メタノール1xで繰り返して、完全な脱水を確実にします。新生児マウスの心臓を各メタノール混合物中で1時間、振とうしながら脱水します。8週齢のマウスの心臓とラットの心臓の潜伏時間を2時間に調整します。
注意:メタノールは揮発性で刺激性があり、可燃性の化学物質です。 - 心臓を新鮮な100%メタノールと交換し、4°Cで10分間冷やします。
- 溶液を交換し、体積比1:5(30%H2O2〜100%メタノール)を使用してメタノール中の5%過酸化水素(H2O2)で心臓を漂白し、4°Cで一晩かけて色素を除去します。
注:顔料を除去することで、光子の吸収を最小限に抑えることができ、アーチファクトを減らして画質を向上させることができます。 - 溶液を交換し、100%メタノール中で室温で1時間心臓をインキュベートします。
- 66%ジクロロメタン(DCM)と33%メタノールを含む溶液で心臓を3時間、振とうしながら脱脂します。このステップの終わりまでに、心臓がバイアルの底に沈むことを確認してください。そうでない場合は、溶液(66%DCM / 33%メタノール)を更新し、インキュベーション時間を延長して(たとえば、さらに1時間)、完全な脱脂を実現します。DCMは非常に揮発性が高いため、乾燥を防ぐために心臓を新鮮な溶液にすばやく移します。
注意:DCMはポリスチレンと互換性がないため、実験にはポリプロピレンまたはガラス器具を使用してください。 - 屈折率マッチングにジベンジルエーテル(DBE)を利用します(RI = 1.56)。新生児マウスの心臓の場合、屈折率の一致のプロセスには2日かかりますが、8週齢のマウスの心臓の場合、軽く振ると5日かかります。新しいDBEと交換し、心臓が完全に透明になるまで潜伏期間を延長します。
注意: DBE は危険です。皮膚との接触を避けてください。
2. サンプル埋込(1日)
注:市販のLSMシステムを使用する場合は、会社が提供する特定のプロトコルに従って心臓を修正し、手順2.1〜2.9をスキップしてください。
- 3DプリンタとOnyx材料を使用して、屈折率マッチングソリューション(iDISCOアプローチのDBEなど)に耐性のあるチャンバーとホルダーをカスタマイズします(図2A)16。
- チャンバーの底部に磁石を取り付けて、LSMシステムの下での迅速な接続と正確な位置特定を容易にします(図2B)。
- 透明なシリコン接着剤を使用して25 mm x 50 mm x 0.17 mmのカバーガラスをチャンバーに取り付け、DBEを充填し、1日後に漏れがないか確認して、チャンバーの防水完全性を確認します。
- 3Dプリンタを使用してクランプホルダーをカスタマイズし、チャンバー内に心臓アセンブリを取り付けるための磁石を取り付け(図2C)、心臓アセンブリを取り付けるためのアガロースゲルに針を挿入します。
- 以前に報告された16,22のように、シリンドリカルレンズと連続波ダイオード励起固体(DPSS)レーザーを使用した自社LSMシステムの開発を実施します。532 nmの励起波長を使用して、心筋からの自家蛍光を捕捉します(図2D)。
- チャンバーを6次元ステージに取り付け、チャンバーがレーザー伝搬方向に垂直になる最適な位置に配置します。
- 磁気クランプホルダーを使用してサンプルをチャンバーの中央に配置し、ホルダーを4次元電動ステージ(X、Y、Z、およびヨー; 図2D)。
- 電動ステージを使用して、DBEで満たされたチャンバーに心臓アセンブリを浸し、検出軸(Z方向)に沿ったスキャン範囲を決定します。
- 次の式を使用して、ステップサイズ(S)と画像の取得時間(T)に基づいて、Z方向に沿ったモーターの走査速度(Vz)を決定します。
注:ステップサイズとイメージングシステムの軸方向分解能の関係は、ナイキストシャノンサンプリング定理に準拠しています。例えば、前報告16で示したように、軸方向の分解能が2.91μmであったことを考えると、ステップサイズは1μmに設定された。 - 空間分解能を検証し、さまざまな深さでの潜在的な不透明度の問題を最小限に抑えるには、濃度1:1.5 x 105の1%低融点アガロースゲルで希釈した直径0.53 μmの蛍光ビーズをイメージングすることにより、システムの点像分布関数(PSF)を測定します。半値全幅(FWHM)を測定して、サンプル全体のPSFを計算します16。
3.画像のステッチング(4〜8時間)
- 限られたFOVを考慮して、マウスの心臓全体を覆うために必要なタイルの数を計算します。各タイルの寸法は、LSM システムの FOV に対応します。たとえば、断面が3 x 3.6 mm2 の新生児マウス心臓の場合、カスタマイズされたLSMでカバーするには2 x 2タイルが必要です(図3A)。対照的に、5 x 8 mm2 を測定する8週齢のマウス心臓は、心臓構造全体を覆うために3 x 4タイルを必要とします(図3B)。
注:従来のLSMでは、心臓全体をイメージングするためのFOVが制限されている場合は、画像スティッチングが必要です。 - タイル1、すなわち心臓の左上隅のタイルから心臓の画像をキャプチャします(図3A-B)。
- 図3Cに示すように、心臓全体が覆われるまで、連続するタイル間で10%オーバーラップして残りのタイルの画像を順次キャプチャします。
- Fiji23 オープンソースソフトウェアをダウンロードしてインストールします。FijiプラグインBigStitcher24をダウンロードしてインストールします。
- [ヘルプ]メニューに移動し、[更新]を選択し、[更新サイトの管理]を選択して、BigStitcherを選択します。続いて、[閉じる]、[変更の適用] の順にクリックします。プラグインのダウンロードが完了したら、Fiji ソフトウェアを再起動します。
- BigStitcherプラグインを開き、必要なすべてのタイルを画像ファイルディレクトリからインポートします。データセットを HDF5 ファイルとして保存します。
- タイルを 整理するには、[タイルを通常のグリッドで移動] を選択し、ハートの移動に使用するパターンを選択し、各タイル間の 10% のオーバーラップを選択します。ステッチウィザードオプションを使用してタイルをステッチします。
- Image Fusionを使用してステッチされたデータをエクスポートし、tiffファイルを生成します。
4. マルチビューデコンボリューション(5日間)
- 蛍光ビーズを利用して、心臓に沿ったマルチビュー再構成の画像レジストレーションを行います(図3D)。
- ビスフェノール-Aジグリシジルエーテル(D.E.R. 332)、イソホロンジアミン、5-アミノ-1,3,3-トリメチルシクロヘキサンメチルアミン(IPDA)、およびポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル(D.E.R 736)を4:1:1の体積比で混合することにより、樹脂25 を調製する。
- 蛍光ビーズ10 μLを161 x g で5分間遠心分離し、メタノール20 μLを加えてビーズの保存溶液を置き換えます。これを3回繰り返します。
- ステップ4.1.1で調製した樹脂にメタノールベースのビーズ溶液を混合して、1:1 x 105 ビーズ濃度の10 mL溶液を調製します。
- 真空チャンバー内で溶液を3時間脱気し、エアポケットと気泡を取り除きます。
- 溶液をシリコン型またはプラスチック製のストローに注ぎ、固まるまで2〜3日待ちます。樹脂が固まる1日後、ガラス管を金型に入れ、樹脂にチューブが付着するまで待ちます。ガラス管で金型から樹脂を取り除きます(図3D)。
- 心臓をガラス管に入れ、DBEで満たし、DBEで満たされたチャンバーにガラス管を取り付けます。
- 検出軸(Z軸;図3E-F)。
注:手順3で画像ステッチを実装して、ハートサイズがFOVを超えた場合に画像の個々のスタックを生成します。 - マウスの心臓をY軸に沿って60°回転させて、0°、60°、120°、180°、240°、300°の複数の角度から後続のスタックをキャプチャします(図3E-F)。
- BigStitcherプラグインを開き、画像ファイルディレクトリからすべての画像をインポートします。データセットを HDF5 ファイルとして保存します。
- Detect Interest Pointsを選択し、登録するビードを手動で選択します。
- 登録に アフィン 変換モデルを選択します。 [ポイント スプレッド関数 ] を選択し、すべてのビューに PSF を割り当てます。
- Multiview Deconvolutionをクリックし、反復のタイプとしてEfficient Bayesianを選択します。反復回数を10と定義し、26を実行します。
- Image Fusionをクリックして、tiffファイルをエクスポートします。
注:マルチビューデコンボリューションの詳細については、他のレポートまたはプロトコル24、27、28を参照してください。
5. 軸方向に掃引されたライトシートシステムハードウェア(1日)
- シリンドリカルレンズ(CL)27 (図2D)のフーリエ面に電気チューナブルレンズ(ETL)を取り付けて、レーザービームを軸方向にスキャンします14。重力による波面歪みを防ぐために、ETLの液体界面が水平であることを確認してください。ETLを正確に位置合わせして、ビームの偏心と高次の光学収差を最小限に抑えます30。
- ワークステーションにDAQカードを取り付け、BNCケーブルをDAQカードに接続して、カメラの露出とETLスキャンを同期させます。
- ETLドライバのハウジングを開き、カバーを取り外します(図4)。
- BNCケーブルの信号線を、PCBボードの底面にラベル付けされているように、Analog in Bピンにはんだ付けします(図4)。
- BNCケーブルのアース線をGNDピンにはんだ付けします。その後、BNCケーブルのもう一方の端をDAQカードのAO(アナログ出力)に接続します(図4)。
- ETLドライバーをワークステーションのUSBポートに接続し、ヒロセ電機ケーブルでETLに接続し、レンズドライバーコントローラーソフトウェアをインストールします。
- レンズドライバコントローラソフトウェアの動作モードをアナログに変更して、DAQカードから生成されたトリガでETLを制御します。
- sCMOSカメラのソフトウェアで、キャプチャモードを外部(ライトシート)に切り替えます。同期を支援するために、アクティブなピクセルスキャン方向がレーザースキャン方向に垂直であることを確認してください。
- BNCケーブルを使用して、sCMOSカメラの背面にある外部トリガポートをDAQカードのAOに接続します(図4)。
6. 軸方向に掃引されたライトシートシステムの同期(7日間)
- 提案された研究で少なくとも 10 である許容可能な S/Background 比 (SBR) に基づいて露光時間を定義します。SBRが10未満の場合は、露光時間を長くします。
注:10〜50 msの範囲の露光時間は、このプロジェクトで許容できるSBRを提供します。 - カメラの露光時間(E)とETL周波数(f)に基づいて、画像の取得時間(T)とライン間隔(L)を次の式で定義します。
ここで、P はカメラ センサーのピクセル列数を示します。リファレンスの代表的なパラメータは、それぞれf = 1 Hz、P = 2048、E = 10 ms、L = 243 μsです。 - LabVIEWプログラムのトリガ Generator.vi で、同期用の正方形と三角形の両方のトリガを生成します(図5)。
メモ: カスタマイズされたLabVIEWプログラムは、合理的な要求に応じて作成者から入手できます。 - 1%低融点アガロースゲル16 で1:1×103 の濃度で希釈した蛍光ビーズをマウントして、画像中のビームウエストの位置を特定する(図6A)。
- プログラムでは、走査方向に沿って電圧を変化させることにより、FOV下のレーザービームの始点と終点を特定します。
- sCMOSカメラとETLを同期させるには、レーザービームをX軸に沿ってスキャンし、アクティブピクセルをY軸に沿ってスキャンして、2D画像を生成します(図6B)。画像の対角線に沿った明るくシャープなビーズは、sCMOSとETLの正確な同期を示しています。
注意: ETLとsCMOSピクセルアクティベーションのスキャン速度の同期は、画質にとって重要です。さまざまな一般的な非同期エラーを図 6C-F にまとめます。 - 同期に最適な同期パラメータを決定したら、sCMOSカメラをZ軸を中心に90°回転させて、アクティブなピクセル方向をレーザースキャン方向に合わせます。
- 前のレポート16で示したのと同じ方法を使用し、ASLMの平均横方向分解能と軸方向分解能をそれぞれ2.18μmと2.88μmとします(図7)。
注意: 理想的な条件下では、FOV全体にわたって均一な照明と解像度を実現できます(図7A-B)。sCMOSカメラによるETLの非同期動作、および照明と検出のずれにより、空間分解能が不均一になる可能性があります(図7C-D)。 - 心臓イメージングの場合、システムを調整し、システム同期に最適なパラメーターを決定した後、手順 2.6 から 2.9 に進みます。
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Representative Results
LSMは、明視野および点走査技術6,8,38,39,40のような他の光学イメージング方法とは対照的に、光損傷のリスクが最小限であり、高い空間分解能、および光学切片化により、心臓研究31,32,33,34,35,36,37を促進することが実証されている.したがって、3D心筋アーキテクチャをよりよく理解するために、適応されたiDISCOクリアリング、画像スティッチング、マルチビューデコンボリューション、ASLMなどの主要なアプローチに基づいてプロトコルを確立しました。マウスモデルを用いて結果を提示しましたが、ラットや他のげっ歯類モデルも提案手法に適していることに注意することが重要です。適合した組織透明化プロトコルにより、P1マウスの心臓を4日以内に透明にし、8週齢のマウスの心臓を7日以内に透明にすることができます(図1B)。このステップは、無傷の心臓における光子の吸収と散乱を最小限に抑えるための出発点として機能します。マルチビューデコンボリューションは、複数の視点からの画像を1つのモデルに融合させることで、軸方向の解像度を向上させることができます。同じ心臓の6つのビューから画像を連続的に記録した後、マルチビューデコンボリューション法は、15時間の計算後、横方向4.68μm、軸方向5.06μmのほぼ等方的な解像度を達成します(図8A)。計算の複雑さを軽減するために、ETLベースのASLMをさらにカスタマイズして、新生児から成体のマウス心臓までの画像化を行いました。この方法では、従来のLSM法と比較して、焦点の合っていない背景を最小限に抑え、画像のコントラストを高めて、緊密に集束したレーザービームで心筋をスキャンできます(図8B)。現在のASLM設計では、システムの平均横方向分解能と軸方向分解能はそれぞれ2.18μmと2.88μmを達成し、心室内の心筋線維柱帯の詳細な調査を可能にします。さらに、画像スティッチングは、単独で、またはマルチビューデコンボリューションまたはASLMと組み合わせて、より大きなサンプルサイズにFOVを拡張するために利用することができます。ステッチングとASLMを統合することで、8週齢のマウスの心臓全体を均一な解像度でカバーすることができ(図8C)、心臓全体の断面を調べるための効果的なソリューションが得られます。
図1:組織透明化プロセス(A)疎水性法では、組織の脱水、脂質抽出、およびジベンジルエーテル(DBE)を有機溶媒として使用して屈折率マッチングを行います。(B)心臓を4%ホルムアルデヒド(PFA)溶液の混合物に浸し、メタノールと脱イオン(DI)水混合物の勾配で脱水します。4°Cでメタノール中の5%H2O2を使用して心臓を漂白します。 サンプルがチューブの底に沈むまで、ジクロロメタン(DCM)とメタノール溶液で心臓を脱脂します。最後に、目的の屈折率を得るために、DBEで心臓をインキュベートします。グリッド線 5 mm。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:軸方向に掃引されたライトシート顕微鏡の概略図(A)カスタマイズされた3Dプリントチャンバー、(B)チャンバーマグネット、(C)クランプホルダー、および(D)ASLMシステム。略語:CL:シリンドリカルレンズ;ETL:電子チューナブルレンズ;IL:照明レンズ;DL:検出レンズ;FW:フィルターホイール;TL:結像レンズ。この図は参考文献16から修正されています。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:画像スティッチングとマルチビューデコンボリューション(A-B)画像スティッチングは、マウスの心臓全体を覆うために使用され、各タイルは隣接するタイルと10%のFOVオーバーラップを持ちます。(C)画像ステッチのためのマウス心臓の動きパターン。(D)ガラス管の端に蛍光ビーズを貼り合わせて画像レジストレーションを容易にし、心臓をDBE入りガラス管の内側に配置することで、マウスの心臓と蛍光ビーズを同時にイメージングすることができます。(E)マルチビューデコンボリューションは、6つの異なる視点から画像を取得し、それぞれが異なる方向から画像を収集します。(F)0°、60°、120°、180°、240°、および300°のさまざまな角度でのP1マウス心臓とビーズの生データ。スケールバー:500μm。この数字は16から修正されています。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4:ASLMシステムのブロック図。 DAQカードを使用してETLカメラとsCMOSカメラを同期します。ETLドライバのハウジングは、信号線とアース線をPCBにはんだ付けするために開かれています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5:LabViewコントロールパネル LabVIEWコントロールパネルは、ETLとsCMOSカメラのアクティブ化されたピクセルを同期するトリガを生成します。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図6:ライトシートの焦点とアクティブ化されたピクセルの同期(A)ライトシートのスキャン範囲の開始点と終了点の識別は、ETLトリガーに適切な電圧を構成することによって実現されます。(B)蛍光ビーズの同期結果は、画像の対角線に沿って明らかです。(C-F)FOV全体にわたる不均一な空間分解能は、sCMOSカメラを使用したETLの非同期操作から生じます。ETL は、アクティブ化されたピクセルよりも遅い (C) または (D) 早くスキャンを開始します。(E-F)焦点領域が画像の対角線と平行ではなく、スキャン速度と起動速度に互換性がないことを示しています。ETLは、sCMOSのアクティブピクセルのスイープよりも(E)高速または(F)低速でスキャンします。スケールバー:200μmこの図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図7:ASLMのトラブルシューティング(A)ライトシートは、検出レンズの焦点距離に正確に配置されます。ETLは、sCMOSセンサーの活性化されたピクセルと同期しながら、伝搬方向に沿ってライトシートの焦点をスキャンします。(B)ETLが正しく整列および同期されている場合の蛍光ビーズのXYビュー。(C-D)焦点面上の蛍光ビーズと断面画像の焦点が合っていない結果、ETLスキャンとレーザー伝搬の間のずれを示しています。スケールバー:挿入図に200μmと10μm。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図8:マウス心臓のライトシートイメージング(A)心室腔内の小柱帯を強調したマルチビューデコンボリューションP1マウス心臓のボリュームレンダリング画像。(B)従来のLSM(左)とASLM(右)で作製した8週齢マウス心臓の断面画像。画像は生データとして提示されます。(C)8週齢のマウス心臓を画像化するための画像スティッチングとASLMの組み合わせで、水平に3つのタイルと垂直に4つのタイルに配置された12個のタイルを含む。スケールバー:500μm。略語:LV:左心室、LA:左心房、RV:右心室、RA:右心房。この図は参考文献16から修正されています。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| プロシージャ | 時間(P1マウス心臓) | 時間(8週齢のマウスの心臓) | 温度 | |||
| 4%PFAで固定 | 一夜 | 一夜 | 4°C | サンプル調製 | ||
| 1x PBSで洗浄 | 30分 | 30分 | RT | |||
| 1x PBSで洗浄 | 30分 | 30分 | RT | |||
| 1x PBSで洗浄 | 30分 | 30分 | RT | |||
| アガロースゲルを埋め込む | 1時間 | 2時間 | RT | |||
| 20%メタノール/80%脱イオン水でインキュベートします。 | 1時間 | 2時間 | RT | 脱水 | ||
| 40%メタノール/60%脱イオン水でインキュベートします。 | 1時間 | 2時間 | RT | |||
| 60%メタノール/40%脱イオン水でインキュベートします。 | 1時間 | 2時間 | RT | |||
| 80%メタノール/20%脱イオン水でインキュベートします | 1時間 | 2時間 | RT | |||
| 100%メタノール中でインキュベート | 1時間 | 2時間 | RT | |||
| 新鮮な100%メタノールでインキュベートします | 1時間 | 2時間 | RT | |||
| 新鮮な100%メタノールでインキュベートします | 10分 | 10分 | 4°C | 色素脱失 | ||
| 5%H2O2/メタノールを含む漂白剤 | 一夜 | 一夜 | 4°C | |||
| 100%メタノール中でインキュベート | 1時間 | 1時間 | RT | |||
| シェーカーに66%DCM / 33%メタノールを含む脱脂物 | 3時間 | 3時間 | RT | 脱脂 | ||
| シェーカー上のDBEでインキュベートします | 2日間 | 5日間 | RT | RI マッチング | ||
表1: 自家蛍光イメージング用にカスタマイズされた組織透明化ステップ。
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Discussion
イメージング、計算、および組織透明化方法の進歩は、心臓の構造と機能を広範囲に調査する比類のない機会を提供しました。これは、無傷のげっ歯類の心臓モデルを使用して、心臓の形態形成と病因の理解を深める大きな可能性を秘めています。同様のアプローチを用いたゼブラフィッシュの心臓のin vivo研究40,41,42,43とは対照的に、高度なLSM技術と組織透明化法の統合により、げっ歯類モデルをイメージングする際の空間分解能と浸透深さの間の課題を克服することができます9,44.組織透明化技術は、脂質やその他の光散乱要素を除去することによって心臓を光学的に透明にし、より深いイメージング浸透を可能にする45。LSMと組み合わせると、心筋を画像化することができます。この組み合わせにより、イメージングの深さが向上し、複雑な心筋の微細構造の観察が可能になります。数多くの清浄法が確立されているが18、iDISCO20は、他の組織清浄法15と比較して、無傷の心臓を迅速に透明化するように適応し、心筋からの自家蛍光のイメージングに容易に利用できるようにした。特異的な蛍光標識では、オリジナルの iDISCO および Adipo-Clear46 プロトコルを、インキュベーション期間が長いにもかかわらず、このカスタマイズされたイメージングシステムで免疫染色と組み合わせることができます。一方、内因性蛍光を保持し、処理時間を短縮する方法が提案研究に好まれます。他の方法とは対照的に、このプラットフォームには次の利点があります。まず、組織透明化に適応したiDISCOプロトコルを利用し、心筋の自家蛍光を維持しながら、1週間未満で心臓を迅速に透明化することができます。第二に、画像スティッチングやマルチビューデコンボリューションなどの計算手法を、この確立された心臓イメージング用のライトシートシステムに組み込みます。最後に、ASLMシステムを設計および同期して、大きなFOV全体で軸方向の分解能を向上させ、ほぼ等方的な分解能で心筋の圧迫と線維柱帯のマルチスケールイメージングと分析を可能にします。
げっ歯類モデルの心臓画像を撮影するために、LSMに基づく4つのアプローチを提供しました:i)スクリーニング目的の従来の方法19、ii)画像スティッチング、iii)マルチビューデコンボリューション、およびiv)ASLMスキャン。モデルによって心臓のサイズが異なることを考慮して、空間分解能、取得速度、FOVの基本的なトレードオフに対処しようとしました。画像スティッチングは、空間分解能を損なう大きなFOVを可能にしますが、マルチビューデコンボリューションまたはASLMと組み合わせることで、拡張FOV全体でほぼ等方的な解像度が得られ、成体マウスの心臓全体をカバーします。さらに、これらの方法の統合により、深部組織の画質とコントラストが向上し、心筋の線維柱帯や心室内の圧迫などの微細構造の3Dモデルの包括的なデジタル再構築が可能になります。しかし、データセットの氾濫、膨大な計算処理コスト、正確な画像レジストレーションの必要性、マルチビューデコンボリューションやイメージングスティッチングにおけるアーティファクトの可能性などが、幅広い用途の妨げとなっています。ASLMは新たな代替手段ですが、システム同期の複雑さ、レーザースキャン戦略、および組織の透明性への依存は、システムの堅牢性に影響を与え、心臓への光損傷のリスクを高める可能性のある課題をもたらします。
LSMイメージングと組織透明化を含むこの方法論は、新生児から成人までの心臓構造を調査するための出発点となります。これは、心臓発生中の特殊な心臓系統とその機能の分布を局在化させる可能性を秘めています47。心臓アプリケーション6,48,49,50,51,52,53に合わせた計算解析の開発により、このフレームワークは、特に心筋梗塞に応答した心臓リモデリングプロセスを調査するために拡張することができます。最終的に、この全体的な戦略は、心臓の形態形成の根底にあるメカニズムを解明し、治療的介入の開発を前進させる可能性を秘めています。
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Disclosures
著者には、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
動物モデルを惜しみなく共有してくれたUTサウスウェスタンメディカルセンターのエリックオルソン博士のグループに感謝の意を表します。UTダラスのDインキュベーターメンバーから提供されたすべての建設的なコメントに感謝します。この研究は、NIH R00HL148493(Y.D.)、R01HL162635(Y.D.)、およびUTダラスSTARSプログラム(Y.D.)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | - | - | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 - 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
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