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Bioengineering

लाइट-शीट इमेजिंग कृंतक दिलों में हृदय संरचना को प्रकट करने के लिए

Published: March 29, 2024 doi: 10.3791/66707
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Center for Imaging and Surgical Innovation, The University of Texas at Dallas, 3Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, UT Southwestern Medical Center

Summary

प्रोटोकॉल कृंतक दिलों में जटिल हृदय संरचनाओं की जांच करने के लिए अनुकूलित ऊतक समाशोधन विधियों के साथ उन्नत प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है, हृदय आकृति विज्ञान और रीमॉडेलिंग की समझ के लिए बड़ी क्षमता रखता है।

Abstract

लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी (एलएसएम) हृदय की जटिल त्रि-आयामी (3 डी) संरचना को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो मौलिक हृदय शरीर विज्ञान और पैथोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हम इसके द्वारा माउस मॉडल में दिल के सूक्ष्म वास्तुकला को स्पष्ट करने के लिए एलएसएम तकनीक के विकास और कार्यान्वयन में तल्लीन करते हैं। कार्यप्रणाली ऊतक समाशोधन तकनीकों के साथ एक अनुकूलित एलएसएम प्रणाली को एकीकृत करती है, जो वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग के लिए हृदय के ऊतकों के भीतर प्रकाश प्रकीर्णन को कम करती है। छवि सिलाई और मल्टीव्यू डिकॉन्वोल्यूशन दृष्टिकोण के साथ पारंपरिक एलएसएम का संयोजन पूरे दिल पर कब्जा करने की अनुमति देता है। अक्षीय संकल्प और देखने के क्षेत्र (एफओवी) के बीच निहित व्यापार बंद को संबोधित करने के लिए, हम आगे एक अक्षीय रूप से बह प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी (एएसएलएम) विधि बाहर फोकस प्रकाश को कम करने और समान रूप से प्रसार दिशा भर में दिल रोशन शुरू करते हैं. इस बीच, iDISCO जैसे ऊतक समाशोधन विधियां प्रकाश प्रवेश को बढ़ाती हैं, गहरी संरचनाओं के दृश्य की सुविधा प्रदान करती हैं और पूरे हृदय में मायोकार्डियम की व्यापक परीक्षा सुनिश्चित करती हैं। प्रस्तावित एलएसएम और ऊतक समाशोधन विधियों का संयोजन कृंतक दिलों में हृदय संरचनाओं को हल करने में शोधकर्ताओं के लिए एक आशाजनक मंच प्रस्तुत करता है, जिसमें कार्डियक मॉर्फोजेनेसिस और रीमॉडेलिंग की समझ के लिए काफी संभावनाएं हैं।

Introduction

दिल की विफलता दुनिया भर में मृत्यु दर का प्रमुख कारण बनी हुई है, मुख्य रूप से परिपक्व कार्डियोमायोसाइट्स1 की पुनर्योजी क्षमता की कमी के कारण। हृदय की जटिल वास्तुकला इसके कार्य में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है और विकास प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। हृदय संरचना की गहन समझ हृदय आकृति विज्ञान की मूलभूत प्रक्रियाओं को स्पष्ट करने और मायोकार्डियल रोधगलन के जवाब में रीमॉडेलिंग के लिए आवश्यक है। हाल की प्रगति से पता चला है कि नवजात चूहों चोट के बाद हृदय समारोह बहाल कर सकते हैं, जबकि वयस्क चूहों ऐसी पुनर्योजी क्षमता2 की कमी. यह माउस मॉडल में संरचनात्मक और कार्यात्मक असामान्यताओं के साथ जुड़े संकेतों की जांच के लिए एक नींव स्थापित करता है. पारंपरिक इमेजिंग विधियों, जैसे कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, में तकनीकी सीमाएं हैं, जिनमें प्रतिबंधित प्रवेश गहराई, धीमी बिंदु-स्कैनिंग योजना और लेजर प्रकाश के लंबे समय तक संपर्क से फोटो क्षति शामिल है। ये अक्षुण्ण हृदय की व्यापक त्रि-आयामी (3 डी) इमेजिंग में बाधा डालते हैं। इस संदर्भ में, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी (LSM) उच्च गति इमेजिंग, कम फोटो क्षति, और असाधारण ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमताओं 3,4,5 के फायदे की पेशकश एक शक्तिशाली समाधान के रूप में उभरता है. एलएसएम की अनूठी विशेषताएं इसे पारंपरिक तकनीकों की सीमाओं को दूर करने के लिए एक आशाजनक विधि के रूप में स्थान देती हैं, हृदय विकास और रीमॉडेलिंग प्रक्रियाओं 6,7,8में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करती हैं।

इस प्रोटोकॉल में, हम एक इमेजिंग रणनीति है कि अनुकूलित ऊतक समाशोधन दृष्टिकोण9 के साथ उन्नत एलएसएम को जोड़ती है, विशिष्ट लेबलिंग और यांत्रिक सेक्शनिंग के लिए आवश्यकता के बिना पूरे माउस दिल की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है परिचय देते हैं. हम आगे प्रस्ताव करते हैं कि अक्षीय संकल्प में सुधार के लिए पारंपरिक एलएसएम इमेजिंग को मल्टीव्यू डिकोनवल्शन 10 या अक्षीय रूप से बहने वाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी (एएसएलएम) तकनीकों11,12,13,14,15 के माध्यम से बढ़ाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इन तरीकों में से किसी के साथ छवि सिलाई का एकीकरण स्थानिक संकल्प और देखने के क्षेत्र (एफओवी) के बीच व्यापार-बंद को प्रभावी ढंग से दूर कर सकता है, जिससे वयस्क माउस दिलों की इमेजिंग को आगे बढ़ाया जा सकता है। हाइड्रोफोबिक, हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोजेल-आधारित तरीकों सहित कई ऊतक समाशोधन दृष्टिकोणों का समावेश, पूरे दिल 16,17,18,19की आकृति विज्ञान को पकड़ने के लिए गहरी प्रकाश पैठ को सक्षम बनाता है।

जबकि कई समाशोधन विधियां वर्तमान एलएसएम प्रणालियों के साथ संगत हैं, लक्ष्य फोटॉन बिखरने को कम करना और हृदय की तरह ऊतकों में प्रकाश प्रवेश को बढ़ाना है, लिपिड को एक माध्यम के साथ बदलकर जो इसके अपवर्तक सूचकांक से निकटता से मेल खाता है। आईडीआईएससीओ को प्रतिनिधि20,21 के रूप में चुना गया था और इसकी तेजी से प्रसंस्करण और उच्च पारदर्शिता(चित्रा 1ए)के कारण इस प्रोटोकॉल में ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया गया था। सामूहिक रूप से, ऊतक समाशोधन तकनीकों के साथ उन्नत एलएसएम दृष्टिकोण का एकीकरण कृंतक दिलों में जटिल कार्डियक शरीर रचना को उजागर करने के लिए एक आशाजनक ढांचा प्रदान करता है, जिसमें कार्डियक मॉर्फोजेनेसिस और रोगजनन की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण क्षमता है।

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Protocol

पशु प्रोटोकॉल और प्रयोगों को मंजूरी दे दी है और डलास संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC # 21-03) में टेक्सास विश्वविद्यालय की देखरेख में आयोजित किया गया है. C57BL6 चूहों, प्रसवोत्तर दिन में नवजात शिशुओं सहित 1 (P1) और 8 सप्ताह पुराने वयस्कों, इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया. पुरुषों और महिलाओं के बीच कोई अंतर नहीं देखा गया था। सभी डेटा अधिग्रहण और छवि पोस्ट-प्रोसेसिंग ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर या अनुसंधान या शैक्षिक लाइसेंस वाले प्लेटफार्मों का उपयोग करके किए गए थे। उचित अनुरोध पर लेखकों से संसाधन उपलब्ध हैं।

1. नमूना तैयार करना और ऊतक समाशोधन (6 - 10 दिन)

  1. ऊतक समाशोधन प्रक्रिया शुरू करने से पहले ऊतक समाशोधन विधि के लिए आवश्यक सामग्री की तालिका में सभी रासायनिक समाधान तैयार करें।
    नोट: उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते समय एक धूआं हुड में सभी प्रक्रियाएं करें, खासकर जब जहरीले रसायनों को संभालते हैं।
  2. पूरे दिल संग्रह के लिए पी 1 और 8 सप्ताह जैसे वांछित समय बिंदुओं पर सीओ2 कक्ष में रखकर सीओ2 के साथ जानवरों को इच्छामृत्यु दें और डायस्टोल16 में गिरफ्तार करने के लिए 0.2 एम केसीएल में कमरे के तापमान (आरटी) पर ताजा पृथक दिल को विसर्जित करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर कार्डियक शरीर रचना को संरक्षित करने के लिए रात भर एक घुमाव पर कोमल आंदोलन के साथ 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में विसर्जित करके दिल को ठीक करें, तालिका 1 देखें।
    चेतावनी: पीएफए एक जहरीला रसायन है और एक धूआं हुड के तहत किया जाना चाहिए.
  4. 30 मिनट, 3x के लिए आरटी पर 1x पीबीएस के साथ दिल धो लें.
    नोट: वैकल्पिक: नीचे वर्णित के रूप में चरण 2 में कस्टम-निर्मित एलएसएम प्रणाली के लिए दिल विधानसभा बनाने के लिए अगारोज जेल में दिल एम्बेड करें।
    1. पीबीएस में अगारोज को भंग करके 1% अगारोज समाधान तैयार करें और मिश्रण को माइक्रोवेव में पूर्ण विघटन तक गर्म करें। समाधान को नीचे की परत बनाने के लिए एक सांचे में डालें जब तक कि समाधान 40 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा न हो जाए।
    2. दिल को मोल्ड में रखें और मोल्ड को अगारोज जेल से तब तक भरें जब तक कि वह जम न जाए। इमेजिंग में कलाकृतियों को कम करने के लिए agarose जेल में किसी भी बुलबुले को हटा दें.
      नोट: नमूना एम्बेड करने से बढ़ते के दौरान हृदय शरीर रचना को संभावित नुकसान का खतरा कम हो जाता है।
      चेतावनी: कम पिघलने बिंदु agarose का उपयोग करें और ऊंचा तापमान के लिए नमूना उजागर करने के जोखिम को कम करने के लिए गर्म agarose में सीधे दिल रखने से बचें.
  5. विआयनीकृत पानी(चित्रा 1बी)के साथ मिश्रित मेथनॉल के ग्रेडिएंट का उपयोग करके दिल को निर्जलित करें, तालिका 1में उल्लिखित 20%, 40%, 60%, 80% और 100% की अनुक्रमिक सांद्रता के माध्यम से प्रसंस्करण। पूर्ण निर्जलीकरण सुनिश्चित करने के लिए ताजा 100% मेथनॉल 1x के साथ दोहराएं। झटकों के साथ प्रत्येक मेथनॉल मिश्रण में 1 घंटे के लिए निर्जलीकरण नवजात माउस दिल। 8 सप्ताह पुराने माउस दिल और चूहे दिल के लिए 2 घंटे के लिए इनक्यूबेशन समय समायोजित करें.
    चेतावनी: मेथनॉल एक अस्थिर, परेशान और ज्वलनशील रसायन है।
  6. बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ताजा 100% मेथनॉल के साथ दिल सर्द.
  7. समाधान को बदलें और पिगमेंट को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 1: 5 (30% एच2ओ2 से 100% मेथनॉल) की मात्रा अनुपात का उपयोग करके मेथनॉल में 5% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) के साथ दिल को ब्लीच करें।
    नोट: पिगमेंट को हटाने फोटॉन अवशोषण को कम करने की अनुमति देता है, जिससे कम कलाकृतियों के साथ छवि गुणवत्ता में सुधार होता है।
  8. समाधान बदलें और आरटी पर 1 घंटे के लिए 100% मेथनॉल में दिल सेते हैं।
  9. झटकों के साथ 3 घंटे के लिए 66% डाइक्लोरोमीथेन (डीसीएम) और 33% मेथनॉल युक्त समाधान के साथ दिल को हटा दें। सुनिश्चित करें कि दिल इस कदम के अंत तक शीशी के नीचे करने के लिए डूब जाता है. यदि नहीं, तो समाधान (66% डीसीएम / 33% मेथनॉल) को नवीनीकृत करें और पूर्ण लिपिडिटेशन प्राप्त करने के लिए इनक्यूबेशन समय (जैसे, 1 और घंटे) का विस्तार करें। desiccation को रोकने के लिए दिल को जल्दी से एक ताजा समाधान में स्थानांतरित करें, क्योंकि DCM अत्यधिक अस्थिर है।
    चेतावनी: प्रयोग के लिए पॉलीप्रोपाइलीन या कांच के बने पदार्थ का उपयोग करें, क्योंकि डीसीएम पॉलीस्टाइनिन के साथ संगत नहीं है।
  10. अपवर्तक सूचकांक मिलान (आरआई = 1.56) के लिए डिबेंज़िल ईथर (डीबीई) का उपयोग करें। नवजात माउस दिल के लिए, अपवर्तक सूचकांक मिलान की प्रक्रिया में 2 दिन लगते हैं, जबकि 8 सप्ताह पुराने माउस दिल के लिए, हल्के झटकों के साथ 5 दिन लगते हैं। इसे ताजा डीबीई के साथ बदलें और इनक्यूबेशन समय का विस्तार करें जब तक कि दिल पूरी पारदर्शिता प्राप्त न कर ले।
    चेतावनी: डीबीई खतरनाक है। त्वचा के साथ किसी भी संपर्क से बचें।

2. नमूना बढ़ते (1 दिन)

नोट: यदि एक वाणिज्यिक एलएसएम प्रणाली का उपयोग किया जाता है, तो दिल को ठीक करने और चरण 2.1 - 2.9 को छोड़ने के लिए कंपनी द्वारा प्रदान किए गए अपने विशिष्ट प्रोटोकॉल का पालन करें।

  1. एक कक्ष और एक धारक एक 3 डी प्रिंटर और गोमेद सामग्री(चित्रा 2ए)16का उपयोग कर अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान (जैसे, अनुकूलित iDISCO दृष्टिकोण में डीबीई) के लिए प्रतिरोधी अनुकूलित करें.
  2. एलएसएम प्रणाली (चित्रा 2 बी) के तहत त्वरित कनेक्शन और सटीक स्थानीयकरण की सुविधा के लिए कक्ष के नीचे एक चुंबक चिपकाएं।
  3. पारदर्शी सिलिकॉन गोंद का उपयोग करके कक्ष में 25 मिमी x 50 मिमी x 0.17 मिमी कवर चश्मा संलग्न करें और इसे डीबीई के साथ भरकर और 1 दिन के बाद लीक की जांच करके कक्ष की जलरोधक अखंडता को सत्यापित करें।
  4. एक 3 डी प्रिंटर का उपयोग कर एक दबाना धारक को अनुकूलित करें और कक्ष (चित्रा 2C) के अंदर दिल विधानसभा बढ़ते के लिए एक चुंबक प्रत्यय या दिल विधानसभा बढ़ते के लिए agarose जेल में एक सुई डालने.
  5. एक बेलनाकार लेंस और निरंतर-तरंग डायोड-पंप ठोस राज्य (डीपीएसएस) लेजर का उपयोग करके एक इन-हाउस एलएसएम प्रणाली के विकास को पूरा करें जैसा कि पहले16,22 बताया गया था। मायोकार्डियम (चित्रा 2 डी) से ऑटोफ्लोरेसेंस को पकड़ने के लिए 532 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें।
  6. चैम्बर को 6-आयामी चरण पर माउंट करें और इष्टतम स्थिति का पता लगाएं जहां कक्ष लेजर प्रसार की दिशा के लंबवत है।
  7. कक्ष के बीच में नमूना की स्थिति के लिए एक चुंबकीय क्लैंप धारक का उपयोग करें और धारक को 4-आयामी मोटर चालित चरण (एक्स, वाई, जेड, और यॉ; चित्रा 2 डी)।
  8. मोटर चालित चरण का उपयोग करके डीबीई से भरे कक्ष में दिल विधानसभा को डुबोएं और पता लगाने वाली धुरी (जेड-दिशा) के साथ स्कैनिंग रेंज निर्धारित करें।
  9. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके एक छवि (T) के चरण आकार (S) और अधिग्रहण समय के आधार पर Z-दिशा के साथ मोटर के स्कैनिंग वेग (Vz) का निर्धारण करें:
    Equation 1
    नोट: इमेजिंग सिस्टम के चरण आकार और अक्षीय रिज़ॉल्यूशन के बीच संबंध Nyquist-शैनन नमूना प्रमेय का पालन करता है। उदाहरण के लिए, कदम आकार 1 माइक्रोन पर सेट किया गया था, यह देखते हुए कि अक्षीय संकल्प 2.91 माइक्रोन था, जैसा कि पिछली रिपोर्ट16 में संकेत दिया गया है।
  10. स्थानिक संकल्प को सत्यापित करने और विभिन्न गहराई पर संभावित अस्पष्टता के मुद्दों को कम करने के लिए, 1:1.5 x 105 की एकाग्रता के साथ 1% कम पिघलने बिंदु agarose जेल में पतला 0.53 माइक्रोन के व्यास के साथ इमेजिंग फ्लोरोसेंट मोती द्वारा प्रणाली के बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) को मापें। आधे अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम)16पर पूरी चौड़ाई को मापकर पूरे नमूने में पीएसएफ की गणना करें।

3. छवि सिलाई (4-8 घंटे)

  1. सीमित FOV पर विचार करते हुए, पूरे माउस दिल को कवर करने के लिए आवश्यक टाइल्स की संख्या की गणना. प्रत्येक टाइल के लिए, आयाम एलएसएम प्रणाली के एफओवी के अनुरूप हैं। उदाहरण के लिए, 3 x 3.6 मिमी2 के क्रॉस-अनुभागीय माप के साथ एक नवजात माउस दिल को अनुकूलित एलएसएम(चित्रा 3ए)में कवरेज के लिए 2 x 2 टाइलों की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, 5 x 8 मिमी2 मापने वाले 8 सप्ताह पुराने माउस दिल को पूरे हृदय संरचना(चित्रा 3बी)को कवर करने के लिए 3 x 4 टाइलों की आवश्यकता होती है।
    नोट: छवि सिलाई की आवश्यकता होती है यदि पारंपरिक एलएसएम में पूरे दिल की इमेजिंग के लिए एफओवी सीमित है।
  2. टाइल 1 से शुरू दिल की छवियों पर कब्जा, यानी, दिल के ऊपरी बाएँ कोने टाइल (चित्रा 3 ए-बी).
  3. क्रमिक रूप से लगातार टाइलों के बीच 10% ओवरलैप के साथ शेष टाइलों की छवियों को कैप्चर करें जब तक कि पूरे दिल को कवर नहीं किया जाता है, जैसा कि चित्रा 3 सी में दिखाया गया है।
  4. फिजी23 ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर डाउनलोड और इंस्टॉल करें। फिजी प्लगइन, BigStitcher24 डाउनलोड और इंस्टॉल करें।
  5. सहायता मेनू पर नेविगेट करें, अपडेट चुनें, अपडेट साइट प्रबंधित करें चुनें और BigStitcher चुनें। इसके बाद, क्लिक करें बंद करें, उसके बाद परिवर्तन लागू करें. प्लगइन डाउनलोड पूरा करने पर, फिजी सॉफ्टवेयर को पुनरारंभ करें।
  6. BigStitcher प्लगइन खोलें और छवि फ़ाइल निर्देशिका के माध्यम से सभी आवश्यक टाइलें आयात करें। डेटासेट को HDF5 फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  7. नियमित ग्रिड द्वारा टाइल ले जाएँ चुनकर टाइल्स व्यवस्थित करें, दिल चलती के लिए प्रयोग किया जाता है कि पैटर्न का चयन करें, और प्रत्येक टाइल के बीच एक 10% ओवरलैप का चयन करें. स्टिचिंग विज़ार्ड विकल्प का उपयोग करके टाइल्स को स्टिच करें।
  8. छवि फ्यूजन का उपयोग कर सिले डेटा निर्यात, एक tiff फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए.

4. मल्टीव्यू डिकॉन्वोल्यूशन (5 दिन)

  1. दिल के साथ मल्टीव्यू पुनर्निर्माण की छवि पंजीकरण के लिए फ्लोरोसेंट मोतियों का उपयोग करें (चित्र 3डी)।
    1. बिस्फेनॉल-ए डिग्लाइसीडिल ईथर (डीईआर 332), आइसोफोरोन डायमाइन, 5-एमिनो-1,3,3-ट्राइमिथाइलसाइक्लोहेक्सानेमिथाइलमाइन (आईपीडीए), और पॉलीप्रोपाइलीन ग्लाइकोल डाइग्लाइसीडिल ईथर (डीईआर 736) को 4: 1: 1 के वॉल्यूम अनुपात में मिलाकर राल25 तैयार करें।
    2. 5 मिन के लिए 161 x ग्राम पर प्रतिदीप्ति मोतियों के 10 माइक्रोन अपकेंद्रित्र और मोतियों के भंडारण समाधान को बदलने के लिए मेथनॉल के 20 माइक्रोन जोड़ें। इसे 3x दोहराएं।
    3. चरण 4.1.1 में तैयार राल में मेथनॉल आधारित मनका समाधान मिलाकर 1: 1 x 105 मनका एकाग्रता के साथ 10 एमएल समाधान तैयार करें।
    4. हवा की जेब और बुलबुले को हटाने के लिए 3 घंटे के लिए एक वैक्यूम कक्ष में समाधान Degas.
    5. एक सिलिकॉन मोल्ड या प्लास्टिक पीने के भूसे में समाधान डालो और 2 से 3 दिनों तक प्रतीक्षा करें जब तक कि यह जम न जाए। राल ठोस होने से 1 दिन पहले, ग्लास ट्यूब को मोल्ड के अंदर रखें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि ट्यूब राल से जुड़ न जाए। ग्लास ट्यूब (चित्रा 3 डी) के साथ मोल्ड से राल निकालें।
    6. दिल को ग्लास ट्यूब में रखें, इसे डीबीई से भरें, और डीबीई से भरे कक्ष में ग्लास ट्यूब को माउंट करें।
  2. पता लगाने अक्ष (जेड अक्ष; चित्रा 3E-एफ)।
    नोट: यदि दिल का आकार एफओवी से अधिक है, तो छवियों के अलग-अलग ढेर उत्पन्न करने के लिए चरण 3 में छवि सिलाई को लागू करें।
  3. माउस दिल को वाई-अक्ष के साथ 60 ° घुमाएं ताकि बाद के ढेर को कई कोणों से कैप्चर किया जा सके, यानी, 0°, 60°, 120°, 180°, 240°, और 300°(चित्र 3E-F)।
  4. BigStitcher प्लगइन खोलें और छवि फ़ाइल निर्देशिका के माध्यम से सभी छवियों को आयात करें। डेटासेट को HDF5 फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  5. डिटेक्ट इंटरेस्ट पॉइंट्स चुनें और पंजीकरण के लिए मैन्युअल रूप से ब्याज के मोतियों का चयन करें।
  6. पंजीकरण के लिए एफिन परिवर्तन मॉडल का चयन करें। प्वाइंट स्प्रेड फ़ंक्शन चुनें और सभी दृश्यों को पीएसएफ असाइन करें।
  7. Multiview Deconvolution पर क्लिक करें और Efficient Bayesian के रूप में पुनरावृत्ति का प्रकार चुनें। पुनरावृत्तियों की संख्या को 10 के रूप में परिभाषित करें और इसे26 निष्पादित करें।
  8. tiff फ़ाइल निर्यात करने के लिए Image Fusion पर क्लिक करें।
    नोट: मल्टीव्यू डिकोनवोल्यूशन के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी अन्य रिपोर्ट या प्रोटोकॉल 24,27,28में पाई जा सकती है।

5. अक्षीय रूप से बह प्रकाश-शीट सिस्टम हार्डवेयर (1 दिन)

  1. लेजर बीम अक्षीयरूप से स्कैन करने के लिए बेलनाकार लेंस (सीएल)27(चित्रा 2डी)के फूरियर विमान पर एक इलेक्ट्रिक ट्यूनेबल लेंस (ईटीएल) स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि ईटीएल में तरल इंटरफ़ेस गुरुत्वाकर्षण के कारण तरंग विरूपण को रोकने के लिए क्षैतिज है। बीम डिसेंटिंग और उच्च-क्रम ऑप्टिकल विपथन को कम करने के लिए ईटीएल को ठीक से संरेखित करें30.
  2. वर्कस्टेशन में DAQ कार्ड स्थापित करें और कैमरा एक्सपोज़र और ETL स्कैनिंग को सिंक्रनाइज़ करने के लिए BNC केबल को DAQ कार्ड से कनेक्ट करें।
  3. ईटीएल ड्राइवर का आवास खोलें और कवर को हटा दें (चित्र 4)।
  4. बी पिन में एनालॉग के लिए बीएनसी केबल के सिग्नल तार मिलाप, के रूप में पीसीबी बोर्ड (चित्रा 4) के तल पर लेबल के रूप में.
  5. BNC केबल के ग्राउंड वायर को GND पिन में मिलाप करें; उसके बाद BNC केबल के दूसरे छोर को DAQ कार्ड(चित्र 4)में AO (एनालॉग आउटपुट) से कनेक्ट करें।
  6. ईटीएल ड्राइवर को वर्कस्टेशन के यूएसबी पोर्ट में प्लग करें, ड्राइवर को हायरोसे केबल का उपयोग करके ईटीएल से कनेक्ट करें, और लेंस ड्राइवर कंट्रोलर सॉफ्टवेयर इंस्टॉल करें।
  7. DAQ कार्ड से उत्पन्न ट्रिगर के साथ ETL को नियंत्रित करने के लिए लेंस ड्राइवर कंट्रोलर सॉफ़्टवेयर में ऑपरेशन मोड को एनालॉग में बदलें।
  8. SCMOS कैमरे के सॉफ़्टवेयर में, कैप्चर मोड को बाहरी (लाइट-शीट) पर स्विच करें। सुनिश्चित करें कि सिंक्रनाइज़ेशन की सहायता के लिए सक्रिय पिक्सेल स्कैनिंग दिशा लेजर स्कैनिंग दिशा के लंबवत है।
  9. sCMOS कैमरे के पीछे बाहरी ट्रिगर पोर्ट को BNC केबल (चित्र 4) का उपयोग करके DAQ कार्ड के AO से कनेक्ट करें।

6. अक्षीय रूप से बह प्रकाश-शीट प्रणाली तुल्यकालन (7 दिन)

  1. स्वीकार्य सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात (एसबीआर) के आधार पर एक्सपोजर समय को परिभाषित करें जो प्रस्तावित अध्ययन के लिए कम से कम 10 है। SBR से कम है तो जोखिम समय बढ़ाएँ 10.
    नोट: एक्सपोजर समय 10 से 50 एमएस तक इस परियोजना में एक स्वीकार्य एसबीआर प्रदान करता है।
  2. कैमरे के लिए एक्सपोज़र समय (E) और ETL फ़्रीक्वेंसी (f) के आधार पर निम्न समीकरणों का उपयोग करके छवि (T) और रेखा अंतराल (L) का अधिग्रहण समय निर्धारित करें:
    Equation 2
    Equation 3
    जहां पी कैमरा सेंसर पर पिक्सेल कॉलम की संख्या को इंगित करता है। संदर्भ के लिए प्रतिनिधि पैरामीटर क्रमशः f = 1 Hz, P = 2048, E = 10 ms, और L = 243 μs हैं।
  3. LabVIEW कार्यक्रम ट्रिगर Generator.vi में, तुल्यकालन (चित्रा 5) के लिए वर्ग और त्रिकोण ट्रिगर दोनों उत्पन्न करता है.
    नोट: अनुकूलित LabVIEW कार्यक्रम उचित अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध है।
  4. माउंट फ्लोरोसेंट मोती छवि (चित्रा 6ए) में बीम कमर की स्थिति का पता लगाने के लिए 1:1 x 103 की एकाग्रता के साथ 1% कम गलनांक अगारोज जेल16 में पतला होता है।
  5. कार्यक्रम में, स्कैनिंग दिशा के साथ वोल्टेज को बदलकर एफओवी के तहत लेजर बीम के शुरुआती और समाप्ति बिंदुओं की पहचान करें।
  6. एससीएमओएस कैमरा और ईटीएल को सिंक्रनाइज़ करने के लिए, एक्स-अक्ष के साथ लेजर बीम को स्कैन करें और 2 डी छवि(चित्रा 6बी)उत्पन्न करने के लिए वाई-अक्ष के साथ सक्रिय पिक्सल। छवि में विकर्ण के साथ उज्जवल और तेज मोती sCMOS और ETL के बीच सटीक सिंक्रनाइज़ेशन का संकेत देते हैं।
    नोट: ईटीएल और एससीएमओएस पिक्सेल सक्रियण की स्कैनिंग गति का सिंक्रनाइज़ेशन छवि गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण है। चित्रा 6C-F में विभिन्न सामान्य अतुल्यकालिक त्रुटियों को संक्षेपित किया गया है।
  7. सिंक्रनाइज़ेशन के लिए इष्टतम सिंक्रनाइज़ेशन पैरामीटर निर्धारित करने के बाद, लेजर स्कैनिंग दिशा के साथ सक्रिय पिक्सेल दिशा को संरेखित करने के लिए sCMOS कैमरा को Z-अक्ष के चारों ओर 90° घुमाएं।
  8. चरण 2.10 दोहराएं, और पीएसएफ के एफडब्ल्यूएचएम को मापें। पिछली रिपोर्ट16 में बताए अनुसार उसी विधि का उपयोग करें, क्रमशः 2.18 माइक्रोन और 2.88 माइक्रोन के रूप में एएसएलएम के औसत पार्श्व और अक्षीय संकल्पों के साथ(चित्रा 7)।
    नोट: पूरे एफओवी में समान रोशनी और संकल्प आदर्श परिस्थितियों (चित्रा 7ए-बी) के तहत संभव है। एससीएमओएस कैमरे के साथ ईटीएल के अतुल्यकालिक संचालन, साथ ही रोशनी और पहचान के गलत संरेखण, गैर-समान स्थानिक संकल्प (चित्रा 7सी-डी) में परिणाम कर सकते हैं।
  9. कार्डियक इमेजिंग के लिए, सिस्टम को संरेखित करने और सिस्टम सिंक्रनाइज़ेशन के लिए इष्टतम मापदंडों का निर्धारण करने के बाद, 2.6 से 2.9 चरणों के साथ आगे बढ़ें।

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Representative Results

एलएसएम को कार्डियक अध्ययन 31,32,33,34,35,36,37 को बढ़ावा देने के लिए प्रदर्शित किया गया है, क्योंकि अन्य ऑप्टिकल इमेजिंग विधियों जैसे ब्राइटफील्ड और पॉइंट-स्कैनिंग तकनीकों 6,8,38,39,40 के विपरीत फोटो क्षति, उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और ऑप्टिकल सेक्शनिंग के न्यूनतम जोखिम के कारण . इस प्रकार, 3 डी मायोकार्डियल आर्किटेक्चर को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमने अनुकूलित iDISCO समाशोधन, छवि सिलाई, मल्टीव्यू डिकॉन्वोल्यूशन और एएसएलएम सहित प्राथमिक दृष्टिकोणों के आधार पर प्रोटोकॉल स्थापित किया है। जबकि हमने माउस मॉडल का उपयोग करके परिणाम प्रस्तुत किए, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि चूहों और अन्य कृंतक मॉडल भी प्रस्तावित तरीकों के लिए उपयुक्त हैं। अनुकूलित ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल 4 दिनों के भीतर पी 1 माउस दिल पारदर्शी और 7 दिनों के भीतर 8 सप्ताह पुराने माउस दिल पारदर्शी (चित्रा 1 बी) के प्रतिपादन सक्षम बनाता है। यह कदम फोटॉन अवशोषण को कम करने और बरकरार दिल में बिखरने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में कार्य करता है। मल्टीव्यू डिकनवॉल्यूशन एक मॉडल में कई दृष्टिकोणों से छवियों को फ्यूज करके अक्षीय रिज़ॉल्यूशन के सुधार को सक्षम बनाता है। एक ही दिल के 6 विचारों से क्रमिक रूप से छवियों को रिकॉर्ड करने के बाद, मल्टीव्यू डीकोनवल्शन विधि गणना के 15 घंटे(चित्रा 8ए)के बाद 4.68 माइक्रोन के पार्श्व और 5.06 माइक्रोन के अक्षीय के साथ निकट-आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करती है। कम्प्यूटेशनल जटिलता को कम करने के लिए, हमने नवजात से वयस्क माउस दिलों तक छवि के लिए एक ईटीएल-आधारित एएसएलएम को और अनुकूलित किया। यह विधि हमें कसकर केंद्रित लेजर बीम के साथ मायोकार्डियम को स्कैन करने की अनुमति देती है, आउट-ऑफ-फोकस पृष्ठभूमि को कम करती है और पारंपरिक एलएसएम विधियों(चित्रा 8बी)की तुलना में छवि विपरीत को बढ़ाती है। वर्तमान एएसएलएम डिजाइन के साथ, सिस्टम के औसत पार्श्व और अक्षीय संकल्प क्रमशः 2.18 माइक्रोन और 2.88 माइक्रोन प्राप्त करते हैं, जिससे वेंट्रिकल्स में मायोकार्डियल ट्रैबेक्यूलेशन की गहन खोज को सक्षम किया जा सकता है। इसके अलावा, छवि सिलाई का उपयोग स्वतंत्र रूप से किया जा सकता है, या बड़े नमूना आकारों के लिए एफओवी का विस्तार करने के लिए मल्टीव्यू डिकोनवल्शन या एएसएलएम के संयोजन में। एएसएलएम के साथ सिलाई को एकीकृत करने से हमें पूरे दिल के क्रॉस-सेक्शन की जांच करने के लिए एक प्रभावी समाधान प्रदान करते हुए, एक समान संकल्प(चित्रा 8सी)के साथ पूरे 8-सप्ताह पुराने माउस दिल को कवर करने की अनुमति मिलती है।

Figure 1
चित्रा 1: ऊतक समाशोधन प्रक्रिया। (ए) हाइड्रोफोबिक विधि में कार्बनिक विलायक के रूप में डिबेंज़िल ईथर (डीबीई) का उपयोग करके ऊतक निर्जलीकरण, लिपिड निष्कर्षण और अपवर्तक सूचकांक मिलान शामिल है। (बी) दिल को 4% फॉर्मलाडेहाइड (पीएफए) समाधान के मिश्रण में डुबोएं और इसे मेथनॉल और विआयनीकृत (डीआई) पानी के मिश्रण के ढाल के साथ निर्जलित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल में 5% एच2ओ2 का उपयोग करके दिल को ब्लीच करें। डाइक्लोरोमीथेन (डीसीएम) और मेथनॉल समाधान के साथ दिल को तब तक डिलिपिडेट करें जब तक कि नमूना ट्यूब के नीचे तक डूब न जाए। अंत में, वांछित अपवर्तक सूचकांक प्राप्त करने के लिए डीबीई में दिल को इनक्यूबेट करें। ग्रिड लाइनें 5 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: अक्षीय रूप से बह प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के योजनाबद्ध। (ए) अनुकूलित 3 डी मुद्रित कक्ष, (बी) कक्ष चुंबक, (सी) क्लैंप धारक, और (डी) एएसएलएम प्रणाली। संक्षिप्ताक्षर: सीएल: बेलनाकार लेंस; ईटीएल: इलेक्ट्रॉनिक ट्यून करने योग्य लेंस; आईएल: रोशनी लेंस; डीएल: डिटेक्शन लेंस; परिवार कल्याण: फिल्टर व्हील; टीएल: ट्यूब लेंस। यह आंकड़ा रेफरी16 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: छवि सिलाई और multiview deconvolution (एबी) छवि सिलाई अपने आसन्न टाइल्स के साथ एक 10% एफओवी ओवरलैप होने के साथ, पूरे माउस दिल को कवर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (सी) छवि सिलाई के लिए माउस दिल के आंदोलन पैटर्न। (डी)फ्लोरोसेंट मोती छवि पंजीकरण की सुविधा के लिए ग्लास ट्यूब के अंत में चिपका रहे हैं, जबकि दिल डीबीई युक्त ग्लास ट्यूब के अंदर स्थित है, दोनों माउस दिल और फ्लोरोसेंट मोती की समवर्ती इमेजिंग को सक्षम करने. (ई) मल्टीव्यू डिकॉन्वोल्यूशन में छह अलग-अलग दृष्टिकोणों से छवियों का अधिग्रहण शामिल है, प्रत्येक अद्वितीय दिशाओं से छवियों को इकट्ठा करता है। (एफ)0 डिग्री, 60 डिग्री, 120 डिग्री, 180 डिग्री, 240 डिग्री, और 300 डिग्री के विभिन्न कोणों पर पी 1 माउस दिल और मोतियों का कच्चा डेटा। स्केल बार: 500 माइक्रोन। यह आंकड़ा16 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एएसएलएम प्रणाली का ब्लॉक आरेख। ETL और sCMOS कैमरा सिंक्रनाइज़ करने के लिए DAQ कार्ड का उपयोग करना। ईटीएल चालक का आवास पीसीबी को सिग्नल और ग्राउंड वायर के टांका लगाने के लिए खोला गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: लैबव्यू कंट्रोल पैनल। ईटीएल और एससीएमओएस कैमरा के सक्रिय पिक्सल को सिंक्रनाइज़ करने के लिए ट्रिगर उत्पन्न करने के लिए लैबव्यू कंट्रोल पैनल। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: सक्रिय पिक्सल के साथ लाइट-शीट के फोकस को सिंक्रनाइज़ करना। (ए) लाइट-शीट स्कैनिंग रेंज के शुरुआती और समाप्ति बिंदुओं की पहचान ईटीएल ट्रिगर के लिए उपयुक्त वोल्टेज को कॉन्फ़िगर करके प्राप्त की जाती है। (बी) फ्लोरोसेंट मोतियों का तुल्यकालिक परिणाम छवि के विकर्ण के साथ स्पष्ट है। (सीएफ) पूरे FOV में गैर-समान स्थानिक रिज़ॉल्यूशन SCMOS कैमरे के साथ ETL के अतुल्यकालिक संचालन से उत्पन्न होता है। ईटीएल स्कैनिंग शुरू करता है (सी) बाद में या (डी) सक्रिय पिक्सेल से पहले। (ई-एफ) फोकल क्षेत्र छवि के विकर्ण के समानांतर नहीं है, जो स्कैनिंग और सक्रियण गति के बीच असंगति का संकेत देता है। ईटीएल स्कैन (ई) तेजी से या (एफ) एससीएमओएस में सक्रिय पिक्सल के स्वीपिंग की तुलना में धीमा। स्केल बार: 200 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: एएसएलएम की समस्या निवारण। (ए) लाइट-शीट को डिटेक्शन लेंस की फोकल दूरी पर बिल्कुल रखा गया है। ईटीएल प्रसार दिशा के साथ लाइट-शीट के फोकस को स्कैन करता है जबकि एससीएमओएस सेंसर के सक्रिय पिक्सेल के साथ सिंक्रनाइज़ करता है। (बी)फ्लोरोसेंट मोतियों का XY दृश्य जब ईटीएल सही ढंग से संरेखित और सिंक्रनाइज़ किया जाता है। (सी-डी) फोकल विमान पर फ्लोरोसेंट मोती के परिणाम और पार अनुभागीय छवियों में बाहर के फोकस, ईटीएल स्कैनिंग और लेजर प्रसार के बीच misalignment का संकेत. स्केल बार: इनसेट में 200 माइक्रोन और 10 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: माउस दिल की प्रकाश शीट इमेजिंग। (ए) मल्टीव्यू deconvolution पी 1 माउस दिल की वॉल्यूम-रेंडर की गई छवि वेंट्रिकुलर गुहा के भीतर trabeculation को उजागर करती है। (बी)पारंपरिक एलएसएम (बाएं) और एएसएलएम (दाएं) द्वारा उत्पन्न 8 सप्ताह पुराने माउस दिल की क्रॉस-अनुभागीय छवियां। छवियों को कच्चे डेटा के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। (सी) 8 सप्ताह पुराने माउस दिल की इमेजिंग के लिए छवि सिलाई और एएसएलएम का संयोजन, जिसमें क्षैतिज रूप से 3 टाइलों में व्यवस्थित 12 टाइलें और लंबवत 4 टाइलें शामिल हैं। स्केल बार: 500 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: एलवी: बाएं वेंट्रिकल, एलए: बाएं आलिंद, आरवी: दाएं वेंट्रिकल, और आरए: दाएं आलिंद। यह आंकड़ा रेफरी16 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रक्रिया समय (P1 माउस दिल) समय (8 सप्ताह पुराना माउस दिल) तापमान
4% पीएफए में फिक्स करें बहुत शीघ्र बहुत शीघ्र 4 डिग्री सेल्सियस नमूना तैयार करना
1x पीबीएस के साथ धो लें 30 मिण्ट 30 मिण्ट प्रारंभ
1x पीबीएस के साथ धो लें 30 मिण्ट 30 मिण्ट प्रारंभ
1x पीबीएस के साथ धो लें 30 मिण्ट 30 मिण्ट प्रारंभ
अगारोज जेल के साथ एम्बेड करें 1 घंटे 2 घंटे प्रारंभ
20% मेथनॉल/80% डीआई पानी में सेते हैं 1 घंटे 2 घंटे प्रारंभ निर्जलीकरण
40% मेथनॉल/60% डीआई पानी में सेते हैं 1 घंटे 2 घंटे प्रारंभ
60% मेथनॉल/40% डीआई पानी में सेते हैं 1 घंटे 2 घंटे प्रारंभ
80% मेथनॉल/20% डीआई पानी में सेते हैं 1 घंटे 2 घंटे प्रारंभ
100% मेथनॉल में सेते हैं 1 घंटे 2 घंटे प्रारंभ
ताजा 100% मेथनॉल में सेते हैं 1 घंटे 2 घंटे प्रारंभ
ताजा 100% मेथनॉल में सेते हैं 10 मिन 10 मिन 4 डिग्री सेल्सियस डिपिग्मेंटेशन
5% एच2ओ2 / मेथनॉल के साथ ब्लीच बहुत शीघ्र बहुत शीघ्र 4 डिग्री सेल्सियस
100% मेथनॉल में सेते हैं 1 घंटे 1 घंटे प्रारंभ
शेकर पर 66% डीसीएम/33% मेथनॉल के साथ डिलीपिडेट करें 3 घंटे 3 घंटे प्रारंभ लिपिडिएशन
शेकर पर डीबीई में इनक्यूबेट करें 2 दिन 5 दिन प्रारंभ आरआई मिलान

तालिका 1: ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए अनुकूलित ऊतक समाशोधन कदम।

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Discussion

इमेजिंग, गणना और ऊतक समाशोधन विधियों की प्रगति ने हृदय संरचना और कार्य की बड़े पैमाने पर जांच करने का एक अनूठा अवसर प्रदान किया है। यह एक अक्षुण्ण कृंतक हृदय मॉडल का उपयोग करके कार्डियक मॉर्फोजेनेसिस और रोगजनन की हमारी समझ को गहरा करने की बड़ी क्षमता रखता है। एक समान दृष्टिकोण40,41,42,43 का उपयोग करके जेब्राफिश दिल के विवो अध्ययनों के विपरीत, उन्नत एलएसएम तकनीकों और ऊतक समाशोधन विधियों का एकीकरण हमें कृंतक मॉडल 9,44 इमेजिंग करते समय स्थानिक संकल्प और प्रवेश गहराई के बीच चुनौतियों को दूर करने में सक्षम बनाता है. ऊतक समाशोधन तकनीक लिपिड और अन्य प्रकाश बिखरने तत्वों को हटाने, गहरी इमेजिंग पैठ45 को सक्षम करके वैकल्पिक रूप से पारदर्शी दिल प्रस्तुत करना. एलएसएम के साथ युग्मित होने पर, हम मायोकार्डियम की छवि बनाने में सक्षम होते हैं। यह संयोजन इमेजिंग गहराई को बढ़ाता है और जटिल मायोकार्डियल सूक्ष्म संरचना के अवलोकन के लिए अनुमति देता है। कई समाशोधन विधियों18 स्थापित किया गया है, हम तेजी से अन्य ऊतक समाशोधन विधियों15 के साथ तुलना में बरकरार दिल पारदर्शी प्रस्तुत करने के लिए iDISCO20 अनुकूलित है, यह आसानी से मायोकार्डियम से autofluorescence की इमेजिंग के लिए उपलब्ध बनाने. विशिष्ट प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए, मूल iDISCO और Adipo-Clear46 प्रोटोकॉल को लंबे समय तक इनक्यूबेशन के बावजूद, इस अनुकूलित इमेजिंग सिस्टम में इम्यूनोस्टेनिंग के साथ जोड़ा जा सकता है। इस बीच, अंतर्जात प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने और कम प्रसंस्करण समय की आवश्यकता वाले तरीकों को प्रस्तावित अध्ययन के लिए प्राथमिकता दी जाती है। अन्य तरीकों के विपरीत, यह मंच निम्नलिखित लाभ प्रदान करता है। सबसे पहले, हम ऊतक समाशोधन के लिए एक अनुकूलित iDISCO प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं, जिससे मायोकार्डियम ऑटोफ्लोरेसेंस को बनाए रखते हुए 1 सप्ताह से भी कम समय में हृदय पारदर्शी का तेजी से प्रतिपादन सक्षम होता है। दूसरे, हम कार्डियक इमेजिंग के लिए इस स्थापित लाइट-शीट सिस्टम में इमेज स्टिचिंग और मल्टीव्यू डिकॉन्वोल्यूशन जैसे कम्प्यूटेशनल तरीकों को शामिल करते हैं। अंत में, हम एक बड़े एफओवी में अक्षीय संकल्प को बढ़ाने के लिए एएसएलएम प्रणाली को डिजाइन और सिंक्रनाइज़ करते हैं, जिससे मल्टीस्केल इमेजिंग और निकट आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन पर मायोकार्डियल संघनन और ट्रैबक्यूलेशन का विश्लेषण सक्षम होता है।

कृंतक मॉडल की हृदय छवियों को पकड़ने के लिए, हमने एलएसएम के आधार पर चार दृष्टिकोण प्रदान किए हैं: i) स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए पारंपरिक विधि19, ii) छवि सिलाई, iii) मल्टीव्यू डिकोनवल्यूशन, और iv) एएसएलएम स्कैनिंग। विभिन्न मॉडलों में दिल के आकार में भिन्नता को ध्यान में रखते हुए, हमने स्थानिक संकल्प, अधिग्रहण गति और एफओवी में मौलिक व्यापार-बंद को संबोधित करने की मांग की। जबकि छवि सिलाई समझौता स्थानिक संकल्प के साथ बड़े एफओवी सक्षम बनाता है, यह multiview deconvolution या ASLM के साथ संयोजन पूरे वयस्क माउस दिल को कवर करने के लिए विस्तारित FOV भर में निकट-isotropic संकल्प प्रदान करता है. इसके अलावा, इन विधियों का एकीकरण गहरे ऊतक में छवि गुणवत्ता और कंट्रास्ट को बढ़ाता है, जिससे वेंट्रिकल्स के अंदर मायोकार्डियल ट्रैबेक्यूलेशन और संघनन जैसे सूक्ष्म संरचनाओं के 3 डी मॉडल के व्यापक डिजिटल पुनर्निर्माण की अनुमति मिलती है। हालांकि, डेटासेट की जलप्रलय, व्यापक कम्प्यूटेशनल प्रसंस्करण लागत, सटीक छवि पंजीकरण की आवश्यकता, और मल्टीव्यू डिकॉन्वोल्यूशन और इमेजिंग सिलाई में कलाकृतियों की क्षमता उनके व्यापक अनुप्रयोगों में बाधा डालती है। जबकि एएसएलएम एक उभरता हुआ विकल्प है, सिस्टम सिंक्रनाइज़ेशन, लेजर स्कैनिंग रणनीतियों की जटिलता, और ऊतक पारदर्शिता पर निर्भरता चुनौतियों का सामना करती है जो सिस्टम की मजबूती को प्रभावित कर सकती हैं और दिल को फोटो क्षति के जोखिम को बढ़ा सकती हैं।

सामूहिक रूप से, एलएसएम इमेजिंग और ऊतक समाशोधन सहित यह पद्धति नवजात शिशुओं से वयस्कों तक हृदय संरचना का पता लगाने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करती है। यह हृदय विकास47 के दौरान विशेष हृदय वंश और उनके कार्यों के वितरण स्थानीयकृत करने की क्षमता रखती है. कार्डियकअनुप्रयोगों 6,48,49,50,51,52,53 के लिए सिलवाया कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के विकास के साथ, इस ढांचे को कार्डियक रीमॉडेलिंग प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, विशेष रूप से मायोकार्डियल रोधगलन के जवाब में। अंततः, यह समग्र रणनीति कार्डियक मॉर्फोजेनेसिस के अंतर्निहित तंत्र को उजागर करने और चिकित्सीय हस्तक्षेपों के विकास को आगे बढ़ाने की क्षमता रखती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम पशु मॉडल को उदारतापूर्वक साझा करने के लिए यूटी साउथवेस्टर्न मेडिकल सेंटर में डॉ एरिक ओल्सन के समूह के प्रति आभार व्यक्त करते हैं। हम यूटी डलास में डी-इनक्यूबेटर सदस्यों द्वारा प्रदान की गई सभी रचनात्मक टिप्पणियों की सराहना करते हैं। इस काम को एनआईएच R00HL148493 (वाईडी), R01HL162635 (वाईडी), और यूटी डलास स्टार्स प्रोग्राम (वाईडी) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Agarose
Low melting point agarose Thermo Fisher 16520050
Deionized water - -
Chemicals for tissue clearing 
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans Sigma-Aldrich 118184
D.E.R.™ 332 Sigma-Aldrich 31185
D.E.R.™ 736 Sigma-Aldrich 31191
Dibenzyl ether (DBE) Sigma-Aldrich 33630
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997
Fluorescent beads Spherotech FP-0556-2
Hydrogen peroxide (H2O2) Sigma-Aldrich 216736
Methanol Sigma-Aldrich 439193
Paraformaldehyde (PFA) Thermo Fisher 47392
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich 79383
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Software and algorithms
Amira Thermo Fisher Scientific 2021.2
BigStitcher Hörl et al.22
Fiji-ImageJ Schindelin et al.20 1.54f
HCImage Live Hamamatsu Photonics 4.6.1.2
LabVIEW National Instruments Corporation 2017 SP1
Key components of the customized light-sheet system
0.63 - 6.3X Zoom body Olympus MVX-ZB10 
10X Illumination objective Nikon MRH00105
1X detection objective Olympus MV PLAPO 1X/0.25 
473nm DPSS Laser Laserglow Technologies LRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS laser Laserglow Technologies LRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS laser Laserglow Technologies LRS-0589-GFF-00100-05
BNC connector National Instrument BNC-2110
Cylindrical lens Thorlabs ACY254-050-A
DC-Motor Controller, 4 axes Physik Instrumente C-884.4DC
ETL Optotune EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL Cable Optotune CAB-6-300
ETL Lens Driver Optotune EL-E-4i
Filter Chroma ET525/30
Filter Chroma ET585-40
Filter Chroma ET645-75
Filter wheel  Shutter Instrument LAMBDA 10-B
Motorized translation stage Physik Instrumente L-406.20DG10
Motorized translation stage Physik Instrumente L-406.40DG10
Motorized translation stage Physik Instrumente M-403.4PD
NI multifunction I/O National Instrument PCIe-6363
sCMOS camera Hamamatsu C13440-20CU
Stepper motor Pololu 1474
Tube lens Olympus MVX-TLU

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References

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Almasian, M., Saberigarakani, A., Zhang, X., Lee, B., Ding, Y. Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts. J. Vis. Exp. (205), e66707, doi:10.3791/66707 (2024).

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