Summary
이 프로토콜은 설치류 심장의 복잡한 심장 구조를 조사하기 위해 적응된 조직 투명화 방법과 함께 고급 광시트 현미경을 활용하여 심장 형태 형성 및 리모델링을 이해하는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
Abstract
광시트 현미경(LSM)은 심장의 복잡한 3차원(3D) 구조를 이해하는 데 중추적인 역할을 하며, 기본적인 심장 생리학 및 병리학적 반응에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 이로써 우리는 마우스 모델에서 심장의 미세 구조를 밝히기 위해 LSM 기술의 개발 및 구현에 대해 탐구합니다. 이 방법론은 맞춤형 LSM 시스템과 조직 투명화 기술을 통합하여 체적 이미징을 위해 심장 조직 내 광 산란을 완화합니다. 기존 LSM과 이미지 스티칭 및 멀티뷰 디콘볼루션 접근 방식을 결합하면 심장 전체를 캡처할 수 있습니다. 축 방향 해상도와 시야(FOV) 사이의 본질적인 균형을 해결하기 위해 ASLM(Axially Swept Light-Sheet Microscopy) 방법을 도입하여 초점에서 벗어난 빛을 최소화하고 전파 방향에 걸쳐 심장을 균일하게 비춥니다. 한편, iDISCO와 같은 조직 투명화 방법은 빛 투과를 향상시켜 심부 구조의 시각화를 용이하게 하고 심장 전체의 심근을 종합적으로 검사할 수 있도록 합니다. 제안된 LSM과 조직 투명화 방법의 조합은 설치류 심장의 심장 구조를 해결하는 연구자에게 유망한 플랫폼을 제공하며, 심장 형태 형성 및 리모델링에 대한 이해를 위한 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
Introduction
심부전은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 남아 있으며, 주로 성숙한 심근세포의 재생 능력 부족에 기인합니다1. 심장의 복잡한 구조는 심장의 기능에 중요한 역할을 하며 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 심장 구조에 대한 깊은 이해는 심근 경색에 대한 반응으로 심장 형태 형성 및 리모델링의 기본 과정을 설명하는 데 필수적입니다. 최근의 연구 결과에 따르면 신생아 마우스는 부상 후 심장 기능을 회복할 수 있는 반면, 성체 마우스는 이러한 재생 능력이 부족하다2. 이는 마우스 모델의 구조적 및 기능적 이상과 관련된 단서를 조사하기 위한 기반을 마련합니다. 컨포칼 현미경과 같은 기존 이미징 방법은 제한된 침투 깊이, 느린 포인트 스캐닝 방식, 레이저 광에 장기간 노출로 인한 사진 손상 등 기술적 한계가 있습니다. 이는 온전한 심장의 포괄적인 3차원(3D) 이미징을 방해합니다. 이러한 맥락에서 광시트 현미경(LSM)은 고속 이미징, 사진 손상 감소 및 탁월한 광학 절편 기능의 이점을 제공하는 강력한 솔루션으로 부상하고 있습니다 3,4,5. LSM의 고유한 특징은 기존 기술의 한계를 극복할 수 있는 유망한 방법으로 자리 매김하여 심장 발달 및 리모델링 과정에 대한 전례 없는 통찰력을 제공합니다 6,7,8.
이 프로토콜에서는 고급 LSM과 적응된 조직 투명화 접근법9을 결합한 이미징 전략을 도입하여 특정 라벨링 및 기계적 절편 없이 전체 마우스 심장을 이미징할 수 있습니다. 또한, 종래의 LSM 이미징이 멀티뷰 디콘볼루션(multiview deconvolution)10 또는 축방향 스윕 광시트 현미경(ASLM) 기법(11,12,13,14,15)을 통해 향상되어 축 해상도를 향상시킬 수 있음을 제안한다. 또한 이러한 방법 중 하나와 이미지 스티칭을 통합하면 공간 해상도와 시야(FOV) 간의 균형을 효과적으로 극복할 수 있으므로 성인 마우스 심장의 이미징을 발전시킬 수 있습니다. 소수성, 친수성 및 하이드로겔 기반 방법을 포함한 수많은 조직 투명화 접근법의 통합은 전체 심장의 형태를 포착하기 위한 더 깊은 빛 투과를 가능하게 합니다 16,17,18,19.
현재 LSM 시스템에는 여러 가지 투명화 방법이 호환되지만, 목표는 지질을 굴절률과 밀접하게 일치하는 매질로 대체하여 광자 산란을 최소화하고 심장과 같은 조직에서 빛 투과를 향상시키는 것입니다. iDISCO는 대표적인20,21로 선정되었으며 빠른 처리와 높은 투명성으로 인해 이 프로토콜에서 자가형광 이미징에 적합했습니다(그림 1A). 종합적으로, 고급 LSM 접근법과 조직 투명화 기술의 통합은 설치류 심장의 복잡한 심장 해부학을 풀 수 있는 유망한 프레임워크를 제공하며, 심장 형태 형성 및 발병 기전에 대한 이해를 발전시킬 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.
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Protocol
동물 프로토콜 및 실험은 텍사스 대학교 댈러스 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC #21-03)의 감독하에 승인 및 수행되었습니다. 이 연구에는 출생 후 1일차(P1)의 신생아와 8주 된 성인을 포함한 C57BL6 마우스가 사용되었습니다. 남성과 여성 사이에는 차이가 관찰되지 않았다. 모든 데이터 수집 및 이미지 후처리는 연구 또는 교육용 라이선스가 있는 오픈 소스 소프트웨어 또는 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다. 리소스는 합당한 요청에 따라 저자가 사용할 수 있습니다.
1. 시료 전처리 및 조직 투명화(6 - 10일)
- 조직 투명화 절차를 시작하기 전에 조직 투명화 방법에 필요한 재료 표 의 모든 화학 용액을 준비하십시오.
알림: 특히 독성 화학 물질을 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 흄 후드에서 모든 절차를 수행하십시오. - CO2가 있는 동물을 P1 및 8주와 같은 원하는 시점에CO2 챔버에 넣어 전체 심장 채취를 위해 안락사시키고 갓 격리된 심장을 0.2M KCl의 실온(RT)에 담가 이완기16에서 정지시킵니다.
- 4x 인산염 완충 식염수(PBS)에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 넣고 밤새 로커에서 부드럽게 교반하여 심장을 고정하여 심장 해부학적 구조를 4°C에서 보존합니다( 표 1 참조).
주의 : PFA는 독성 화학 물질이므로 흄 후드 아래에서 수행해야 합니다. - RT에서 1x PBS로 30분, 3x 심장을 씻습니다.
참고: 선택 사항: 아래 설명된 대로 2단계에서 맞춤형 LSM 시스템용 하트 어셈블리를 만들려면 아가로스 겔에 심장을 내장합니다.- PBS에 아가로스를 녹여 1% 아가로스 용액을 준비하고 혼합물을 전자레인지에서 완전히 용해될 때까지 가열합니다. 용액을 금형에 붓고 용액이 40°C로 냉각될 때까지 바닥층을 만듭니다.
- 심장을 틀에 넣고 굳어질 때까지 아가로스 젤로 틀을 채웁니다. 이미징의 아티팩트를 최소화하기 위해 아가로스 겔의 기포를 제거합니다.
알림: 샘플을 삽입하면 장착 중 심장 해부학에 대한 잠재적인 손상 위험을 줄일 수 있습니다.
주의: 저융점 아가로스를 사용하고 심장을 가열된 아가로스에 직접 두지 마십시오.ample가 고온에 노출될 위험을 완화하십시오.
- 탈이온수(그림 1B)와 혼합된 메탄올의 구배를 사용하여 심장을 탈수하고 표 1에 설명된 대로 20, 40%, 60%, 80% 및 100%의 순차적 농도를 통해 처리합니다. 완전한 탈수를 보장하기 위해 신선한 100% 메탄올 1x로 반복합니다. 신생아 쥐의 심장을 흔들어 각 메탄올 혼합물에서 1시간 동안 탈수시킵니다. 8주 된 쥐 심장과 쥐 심장의 경우 배양 시간을 2시간으로 조정합니다.
주의: 메탄올은 휘발성, 자극성 및 가연성 화학 물질입니다. - 심장을 신선한 100% 메탄올로 교체하고 4°C에서 10분 동안 식힙니다.
- 용액을 교체하고 4°C에서 하룻밤 동안 1:5(30% H2O2-100% 메탄올)의 부피 비율로 메탄올의 5%과산화수소(H2O2)로 심장을 표백하여 색소를 제거합니다.
참고: 색소를 제거하면 광자 흡수를 최소화할 수 있어 아티팩트를 줄이고 이미지 품질을 향상시킬 수 있습니다. - 용액을 교체하고 RT에서 1시간 동안 100% 메탄올로 심장을 배양합니다.
- 66% 디클로로메탄(DCM)과 33% 메탄올을 함유한 용액으로 3시간 동안 흔들어 심장을 박리합니다. 이 단계가 끝날 때까지 심장이 바이알 바닥으로 가라앉는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 용액(66% DCM / 33% 메탄올)을 갱신하고 배양 시간(예: 1시간 추가)을 연장하여 완전한 탈지화를 달성합니다. DCM은 휘발성이 높기 때문에 건조를 방지하기 위해 심장을 새로운 용액으로 빠르게 옮깁니다.
주의: DCM은 폴리스티렌과 호환되지 않으므로 실험에 폴리프로필렌 또는 유리 제품을 사용하십시오. - 굴절률 정합을 위해 디벤질 에테르(DBE)를 사용합니다(RI = 1.56). 신생아 쥐 심장의 경우 굴절률 일치 과정에 2일이 소요되며, 8주 된 쥐 심장의 경우 가벼운 흔들림으로 5일이 걸립니다. 새로운 DBE로 교체하고 심장이 완전히 투명해질 때까지 배양 시간을 연장합니다.
주의: DBE는 위험합니다. 피부와의 접촉을 피하십시오.
2. 샘플 장착(1일)
주: 상용 LSM 시스템을 사용하는 경우 회사에서 제공하는 특정 프로토콜에 따라 심장을 수리하고 2.1 - 2.9단계를 건너뜁니다.
- 3D 프린터와 Onyx 재료를 사용하여 굴절률 매칭 솔루션(예: 적응형 iDISCO 접근 방식의 DBE)에 내성이 있는 챔버와 홀더를 사용자 정의합니다(그림 2A)16.
- 챔버 바닥에 자석을 부착하여 LSM 시스템에서 빠른 연결과 정확한 위치 파악을 용이하게 합니다(그림 2B).
- 투명 실리콘 접착제를 사용하여 25mm x 50mm x 0.17mm 커버 유리를 챔버에 부착하고 DBE로 채우고 1일 후 누출 여부를 확인하여 챔버의 방수 무결성을 확인합니다.
- 3D 프린터를 사용하여 클램프 홀더를 사용자 정의하고 챔버 내부에 심장 어셈블리를 장착하기 위한 자석을 부착하거나(그림 2C) 심장 어셈블리를 장착하기 위해 아가로스 젤에 바늘을 삽입합니다.
- 이전에 보고된 대로 원통형 렌즈와 연속파 다이오드 펌핑 고체(DPSS) 레이저를 사용하여 사내 LSM 시스템 개발을 수행합니다16,22. 532nm의 여기 파장을 사용하여 심근에서 자가형광을 캡처합니다(그림 2D).
- 챔버를 6차원 스테이지에 장착하고 챔버가 레이저 전파 방향에 수직인 최적의 위치를 찾습니다.
- 마그네틱 클램프 홀더를 사용하여 샘플을 챔버 중앙에 배치하고 홀더를 4차원 전동 스테이지(X, Y, Z 및 Yaw; 그림 2D).
- 전동 스테이지를 사용하여 DBE로 채워진 챔버에 심장 어셈블리를 담그고 감지 축(Z 방향)을 따라 스캐닝 범위를 결정합니다.
- 다음 방정식을 사용하여 이미지의 단계 크기(S)와 획득 시간(T)을 기반으로 Z 방향을 따라 모터의 스캐닝 속도(V, z)를 결정합니다.
참고: 이미징 시스템의 단계 크기와 축 방향 해상도 간의 관계는 Nyquist-Shannon 샘플링 정리를 따릅니다. 예를 들어, 이전 보고서16에서 나타난 바와 같이, 축 분해능이 2.91 μm인 것을 감안할 때, 스텝 크기는 1 μm로 설정되었다. - 공간 해상도를 확인하고 다양한 깊이에서 잠재적인 불투명도 문제를 최소화하려면 직경이 0.53μm인 형광 비드를 1% 저융점 아가로스 겔에 희석하여 1:1.5 x 105 농도로 이미징하여 시스템의 포인트 확산 함수(PSF)를 측정합니다. FWHM(Full Width at Half Maximum)을 측정하여 전체 샘플에서 PSF를 계산합니다16.
3. 이미지 스티칭 (4-8 시간)
- 제한된 FOV를 고려하여 전체 마우스 심장을 덮는 데 필요한 타일 수를 계산합니다. 각 타일의 치수는 LSM 시스템의 FOV에 해당합니다. 예를 들어, 단면적 측정치가 3 x 3.6mm2인 신생아 쥐의 심장은 맞춤형 LSM에서 커버리지를 위해 2 x 2 타일이 필요합니다(그림 3A). 대조적으로, 5 x 8mm2 크기의 8주 된 쥐의 심장은 전체 심장 구조를 덮기 위해 3 x 4 타일이 필요합니다(그림 3B).
참고: 기존 LSM이 심장 전체를 이미징하기 위한 FOV가 제한된 경우 이미지 스티칭이 필요합니다. - 타일 1, 즉 심장의 왼쪽 상단 모서리 타일에서 시작하여 심장 이미지를 캡처합니다(그림 3A-B).
- 그림 3C와 같이 전체 심장이 덮일 때까지 연속된 타일 사이에 10% 겹치는 나머지 타일의 이미지를 순차적으로 캡처합니다.
- Fiji23 오픈 소스 소프트웨어를 다운로드하여 설치합니다. Fiji 플러그인 BigStitcher24를 다운로드하여 설치하십시오.
- 도움말 메뉴로 이동하여 업데이트를 선택하고 업데이트 사이트 관리를 선택한 다음 BigStitcher를 선택합니다. 그런 다음 Close( 닫기)를 클릭한 다음 Apply changes(변경 사항 적용)를 클릭합니다. 플러그인 다운로드가 완료되면 피지 소프트웨어를 다시 시작하십시오.
- BigStitcher 플러그인을 열고 이미지 파일 디렉토리를 통해 필요한 모든 타일을 가져옵니다. 데이터셋을 HDF5 파일로 저장합니다.
- 일반 그리드로 타일 이동을 선택하여 타일을 구성하고, 하트를 이동하는 데 사용되는 패턴을 선택하고, 각 타일 간에 10% 겹침을 선택합니다. 스티칭 마법사(Stitching Wizard) 옵션을 사용하여 타일을 스티칭합니다.
- Image Fusion을 사용하여 스티칭된 데이터를 내보내 tiff 파일을 생성합니다.
4. 멀티뷰 디콘볼루션(5일)
- 형광 비드를 사용하여 심장을 따라 다중보기 재구성을 이미지 정합합니다(그림 3D).
- 비스페놀-A 디글리시딜 에테르(D.E.R. 332), 이소포론 디아민, 5-아미노-1,3,3-트리메틸시클로헥산메틸아민(IPDA) 및 폴리프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르(D.E.R 736)를 4:1:1의 부피 비율로 혼합하여 수지25 를 제조한다.
- 161 x g 에서 5분 동안 10μL의 형광 비드를 원심분리하고 20μL의 메탄올을 추가하여 비드의 저장 용액을 교체합니다. 3번 반복합니다.
- 10 단계에서 제조 된 수지에 메탄올 기반 비드 용액을 혼합하여 1 : 1 x 105 비드 농도의 4.1.1 mL 용액을 준비합니다.
- 공기 주머니와 기포를 제거하기 위해 진공 챔버에서 3시간 동안 용액을 탈기합니다.
- 용액을 실리콘 몰드나 플라스틱 빨대에 붓고 굳을 때까지 2-3일 동안 기다립니다. 수지가 고체가 되기 1일 전, 유리관을 금형 내부에 넣고 유리관이 수지에 부착될 때까지 기다립니다. 유리관으로 금형에서 수지를 제거합니다(그림 3D).
- 심장을 유리관에 넣고 DBE로 채운 다음 DBE로 채워진 챔버에 유리관을 장착합니다.
- 검출 축(Z축; 그림 3E-F).
참고: 3단계에서 이미지 스티칭을 구현하여 하트 크기가 FOV를 초과하는 경우 개별 이미지 스택을 생성합니다. - 마우스 하트를 Y축을 따라 60° 회전하여 0°, 60°, 120°, 180°, 240°, 300° 등 여러 각도에서 후속 스택을 캡처합니다(그림 3E-F).
- BigStitcher 플러그인을 열고 이미지 파일 디렉토리를 통해 모든 이미지를 가져옵니다. 데이터셋을 HDF5 파일로 저장합니다.
- Detect Interest Points(관심 포인트 감지)를 선택하고 등록할 관심 비드를 수동으로 선택합니다.
- 등록을 위해 아핀 변환 모델을 선택합니다. 점 확산 함수를 선택하고 모든 보기에 PSF를 할당합니다.
- Multiview Deconvolution을 클릭하고 반복 유형을 Efficient Bayesian으로 선택합니다. 반복 횟수를 10으로 정의하고26으로 실행합니다.
- 이미지 퓨전을 클릭하여 tiff 파일을 내보냅니다.
참고: 멀티뷰 디콘볼루션에 대한 자세한 정보는 다른 보고서 또는 프로토콜 24,27,28에서 찾을 수 있습니다.
5. 축 방향 스윕 라이트 시트 시스템 하드웨어(1일)
- 원통형 렌즈(CL)27 (그림 2D)의 푸리에 평면에 전기 조정 가능 렌즈(ETL)를 설치하여 레이저 빔을 축 방향으로 스캔합니다14. 중력으로 인한 파면 왜곡을 방지하기 위해 ETL의 액체 인터페이스가 수평인지 확인하십시오. 빔 디컨터링 및 고차 광학 수차를 최소화하기 위해 ETL을 정밀하게 정렬30.
- 워크스테이션에 DAQ 카드를 설치하고 BNC 케이블을 DAQ 카드에 연결하여 카메라 노출과 ETL 스캔을 동기화합니다.
- ETL 드라이버의 하우징을 열고 덮개를 분리합니다(그림 4).
- BNC 케이블의 신호 와이어를 PCB 기판 하단에 표시된 대로 아날로그 in B 핀에 납땜합니다(그림 4).
- BNC 케이블의 접지선을 GND 핀에 납땜합니다. 그런 다음 BNC 케이블의 다른 쪽 끝을 DAQ 카드의 AO(아날로그 출력)에 연결합니다(그림 4).
- ETL 드라이버를 워크스테이션의 USB 포트에 연결하고, 히로세 케이블을 사용하여 드라이버를 ETL에 연결하고, 렌즈 드라이버 컨트롤러 소프트웨어를 설치합니다.
- 렌즈 드라이버 컨트롤러 소프트웨어의 작동 모드를 아날로그로 변경하여 DAQ 카드에서 생성된 트리거로 ETL을 제어합니다.
- sCMOS 카메라의 소프트웨어에서 캡처 모드를 외부(라이트 시트)로 전환합니다. 동기화를 돕기 위해 활성 픽셀 스캐닝 방향이 레이저 스캐닝 방향과 수직인지 확인하십시오.
- BNC 케이블을 사용하여 sCMOS 카메라 뒷면의 외부 트리거 포트를 DAQ 카드의 AO에 연결합니다(그림 4).
6. 축 방향 스윕 광시트 시스템 동기화(7일)
- 제안된 연구의 경우 최소 10인 허용 가능한 신호 대 배경 비율(SBR)을 기준으로 노출 시간을 정의합니다. SBR이 10 미만인 경우 노출 시간을 늘립니다.
참고: 10에서 50ms 범위의 노출 시간은 이 프로젝트에서 허용 가능한 SBR을 제공합니다. - 다음 방정식을 사용하여 카메라의 노출 시간(E)과 ETL 주파수(f)를 기반으로 이미지의 획득 시간(T)과 라인 간격(L)을 정의합니다.
여기서 P 는 카메라 센서의 픽셀 열 수를 나타냅니다. 레퍼런스의 대표 파라미터는 각각 f = 1Hz, P = 2048, E = 10ms, L = 243μs입니다. - LabVIEW 프로그램 Trigger Generator.vi 에서 동기화를 위해 사각형 및 삼각형 트리거를 모두 생성합니다(그림 5).
참고: 맞춤형 LabVIEW 프로그램은 합당한 요청에 따라 작성자가 사용할 수 있습니다. - 이미지에서 빔 웨이스트의 위치를 찾기 위해 1:1 x 103 농도의 1% 저융점 아가로스 겔16에 희석된 마운트 형광 비드(그림 6A).
- 프로그램에서 스캐닝 방향을 따라 전압을 변경하여 FOV 아래에서 레이저 빔의 시작점과 끝점을 식별합니다.
- sCMOS 카메라와 ETL을 동기화하려면 X축을 따라 레이저 빔을 스캔하고 Y축을 따라 활성 픽셀을 스캔하여 2D 이미지를 생성합니다(그림 6B). 이미지의 대각선을 따라 더 밝고 선명한 비드는 sCMOS와 ETL 간의 정확한 동기화를 나타냅니다.
참고: ETL과 sCMOS 픽셀 활성화의 스캔 속도 동기화는 이미지 품질에 매우 중요합니다. 다양한 일반적인 비동기 오류가 그림 6C-F에 요약되어 있습니다. - 동기화를 위한 최적의 동기화 매개변수를 결정한 후 sCMOS 카메라를 Z축을 중심으로 90° 회전하여 활성 픽셀 방향을 레이저 스캐닝 방향에 맞춥니다.
- 2.10단계를 반복하여 PSF의 FWHM을 측정합니다. 이전 보고서16에 표시된 것과 동일한 방법을 사용하여 ASLM의 평균 측면 및 축 방향 해상도를 각각 2.18μm 및 2.88μm로 사용합니다(그림 7).
참고: 전체 FOV에 걸쳐 균일한 조명과 해상도는 이상적인 조건에서 실현 가능합니다(그림 7A-B). sCMOS 카메라를 사용한 ETL의 비동기 작동과 조명 및 감지의 정렬 불량으로 인해 공간 해상도가 균일하지 않을 수 있습니다(그림 7C-D). - 심장 영상의 경우 시스템을 정렬하고 시스템 동기화를 위한 최적의 매개변수를 결정한 후 2.6-2.9단계를 진행합니다.
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Representative Results
LSM은 명시야 및 포인트 스캐닝 기술과 같은 다른 광학 이미징 방법과 달리 사진 손상의 위험이 최소화되고 공간 해상도가 높으며 광학 절편이 가능하기 때문에 심장 연구(31,32,33,34,35,36,37)를 촉진하는 것으로 입증되었습니다 6,8,38,39,40. 따라서 3D 심근 구조를 더 잘 이해하기 위해 적응형 iDISCO 클리어링, 이미지 스티칭, 멀티뷰 디콘볼루션 및 ASLM을 포함한 기본 접근 방식을 기반으로 프로토콜을 설정했습니다. 우리는 마우스 모델을 사용하여 결과를 제시했지만 쥐 및 기타 설치류 모델도 제안된 방법에 적합하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 적응된 조직 투명화 프로토콜을 통해 P1 마우스 심장은 4일 이내에, 8주 된 마우스 심장은 7일 이내에 투명하게 렌더링할 수 있습니다(그림 1B). 이 단계는 온전한 심장에서 광자 흡수와 산란을 최소화하기 위한 시작점 역할을 합니다. Multiview 디콘볼루션은 여러 관점의 이미지를 단일 모델로 융합하여 축 해상도를 개선할 수 있습니다. 동일한 심장의 6개 뷰에서 이미지를 순차적으로 기록한 후, 멀티뷰 디콘볼루션 방법은 15시간의 계산 후 측면 4.68μm, 축 방향 5.06μm로 거의 등방성 분해능을 달성합니다(그림 8A). 계산의 복잡성을 없애기 위해 ETL 기반 ASLM을 추가로 맞춤화하여 신생아에서 성인 쥐의 심장까지 이미지화했습니다. 이 방법을 사용하면 촘촘하게 집중된 레이저 빔으로 심근을 스캔할 수 있으므로 기존 LSM 방법에 비해 초점이 맞지 않는 배경을 최소화하고 이미지 대비를 향상시킬 수 있습니다(그림 8B). 현재 ASLM 설계를 통해 시스템의 평균 측면 및 축 해상도는 각각 2.18μm 및 2.88μm에 도달하여 심실의 심근 섬유주를 심층적으로 탐색할 수 있습니다. 또한 이미지 스티칭을 독립적으로 사용하거나 멀티뷰 디콘볼루션 또는 ASLM과 함께 사용하여 더 큰 샘플 크기에 맞게 FOV를 확장할 수 있습니다. 스티칭과 ASLM을 통합하면 생후 8주 된 쥐의 심장 전체를 균일한 해상도로 커버할 수 있어(그림 8C) 전체 심장의 단면을 조사할 수 있는 효과적인 솔루션을 제공합니다.
그림 1: 조직 투명화 과정. (A) 소수성 방법은 디벤질 에테르(DBE)를 유기 용매로 사용하여 조직 탈수, 지질 추출 및 굴절률 매칭을 포함합니다. (B) 4% 포름알데히드(PFA) 용액의 혼합물에 심장을 담그고 메탄올과 탈이온수(DI) 혼합물의 그라디언트로 탈수합니다. 4 ° C에서 메탄올에 5 % H2O2 를 사용하여 심장을 표백합니다. 샘플이 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 디클로로메탄(DCM)과 메탄올 용액으로 심장을 제거합니다. 마지막으로 원하는 굴절률을 얻기 위해 DBE에서 심장을 배양합니다. 그리드 선 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: axially swept light-sheet microscopy의 개략도. (A) 맞춤형 3D 프린팅 챔버, (B) 챔버 자석, (C) 클램프 홀더 및 (D) ASLM 시스템. 약어 : CL : 원통형 렌즈; ETL: 전자 조정 가능한 렌즈; IL: 조명 렌즈; DL : 감지 렌즈; FW: 필터 휠; TL: 튜브 렌즈. 이 그림은 참조16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이미지 스티칭 및 멀티뷰 디콘볼루션. (A-B) 이미지 스티칭은 전체 마우스 심장을 덮는 데 사용되며, 각 타일은 인접 타일과 10% FOV 겹칩니다. (C) 이미지 스티칭을 위한 마우스 하트의 움직임 패턴. (D) 형광 비드는 이미지 정합을 용이하게 하기 위해 유리관 끝에 부착되어 있으며, 심장은 DBE가 포함된 유리관 내부에 위치하여 마우스 심장과 형광 비드를 동시에 이미징할 수 있습니다. (E) 멀티뷰 디콘볼루션은 각각 고유한 방향에서 이미지를 수집하는 6개의 서로 다른 관점에서 이미지를 획득하는 것을 포함합니다. (F) 0°, 60°, 120°, 180°, 240° 및 300°의 다양한 각도에서 P1 마우스 심장 및 비드의 원시 데이터. 스케일 바: 500 μm. 이 수치는16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ASLM 시스템의 제품 구성도. ETL 및 sCMOS 카메라를 동기화하기 위해 DAQ 카드를 사용합니다. 신호 및 접지선을 PCB에 납땜하기 위해 ETL 드라이버의 하우징이 열렸습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: LabView 제어판. sCMOS 카메라의 ETL 및 활성화된 픽셀을 동기화하기 위한 트리거를 생성하기 위한 LabVIEW 제어판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: light-sheet의 초점을 활성화된 픽셀과 동기화 . (A) 라이트 시트 스캐닝 범위의 시작 및 종료 지점의 식별은 ETL 트리거에 적합한 전압을 구성하여 달성됩니다. (B) 형광 비드의 동기 결과는 이미지의 대각선을 따라 분명합니다. (C-F) 전체 FOV에 걸친 불균일한 공간 해상도는 sCMOS 카메라를 사용한 ETL의 비동기 작동에서 발생합니다. ETL은 활성화된 픽셀보다 나중에 (C) 또는 (D) 스캔을 시작합니다. (E-F) 초점 영역이 이미지의 대각선과 평행하지 않아 스캔 속도와 활성화 속도가 호환되지 않음을 나타냅니다. ETL은 sCMOS의 활성 픽셀 스윕보다 (E) 빠르거나 (F) 느립니다. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: ASLM의 문제 해결. (A) light-sheet는 detection lens의 초점 거리에 정확히 배치됩니다. ETL은 전파 방향을 따라 광시트의 초점을 스캔하면서 sCMOS 센서의 활성화된 픽셀과 동기화합니다. (B) ETL이 올바르게 정렬되고 동기화된 경우 형광 비드의 XY 보기. (씨-디) 초점면의 형광 비드 결과와 단면 이미지에서 초점이 맞지 않는 결과로, ETL 스캐닝과 레이저 전파 간의 정렬 불량을 나타냅니다. 스케일 바: 삽입부에 200 μm 및 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 쥐 심장의 광시트 이미징. (A) 심실강 내 섬유주를 강조한 multiview deconvolution P1 쥐 심장의 볼륨 렌더링 이미지. (B) 기존 LSM(왼쪽)과 ASLM(오른쪽)으로 생성된 8주 된 쥐 심장의 단면 이미지. 이미지는 원시 데이터로 제공됩니다. (C) 생후 8주 된 쥐의 심장을 이미징하기 위한 이미지 스티칭과 ASLM의 조합으로, 가로로 3개의 타일과 세로로 4개의 타일로 배열된 12개의 타일로 구성됩니다. 눈금자: 500 μm. 약어: LV: 좌심실, LA: 좌심방, RV: 우심실, RA: 우심방. 이 그림은 참조16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 절차 | 시간(P1 마우스 하트) | 시간(8주 된 쥐 심장) | 온도 | |||
| PFA 4%로 고정 | 밤새 | 밤새 | 4°섭씨 | 시료 전처리 | ||
| 1x PBS로 세척 | 30분 | 30분 | 실시간(RT) | |||
| 1x PBS로 세척 | 30분 | 30분 | 실시간(RT) | |||
| 1x PBS로 세척 | 30분 | 30분 | 실시간(RT) | |||
| 아가로스 젤 삽입 | 1시간 | 2시간 | 실시간(RT) | |||
| 20% 메탄올/80% 탈이온수에서 배양합니다. | 1시간 | 2시간 | 실시간(RT) | 탈수 | ||
| 40% 메탄올/60% 탈이온수에서 배양합니다. | 1시간 | 2시간 | 실시간(RT) | |||
| 60% 메탄올/40% 탈이온수에서 배양합니다. | 1시간 | 2시간 | 실시간(RT) | |||
| 80% 메탄올/20% 탈이온수에서 배양합니다. | 1시간 | 2시간 | 실시간(RT) | |||
| 100% 메탄올에서 배양액 | 1시간 | 2시간 | 실시간(RT) | |||
| 신선한 100% 메탄올에서 배양합니다. | 1시간 | 2시간 | 실시간(RT) | |||
| 신선한 100% 메탄올에서 배양합니다. | 10분 | 10분 | 4°섭씨 | 탈색 침착 | ||
| 5 % H2O2 / 메탄올을 함유 한 표백제 | 밤새 | 밤새 | 4°섭씨 | |||
| 100% 메탄올에서 배양액 | 1시간 | 1시간 | 실시간(RT) | |||
| 쉐이커에 66% DCM/33% 메탄올을 함유한 델리피데이트 | 3시간 | 3시간 | 실시간(RT) | 지질화 | ||
| Shaker의 DBE에서 배양합니다. | 2 일 | 5 일 | 실시간(RT) | RI 매칭 | ||
표 1: 자가형광 이미징을 위한 맞춤형 조직 투명화 단계.
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Discussion
이미징, 계산 및 조직 투명화 방법의 발전은 심장 구조와 기능을 광범위하게 조사할 수 있는 비할 데 없는 기회를 제공했습니다. 이는 온전한 설치류 심장 모델을 사용하여 심장 형태 형성 및 발병 기전에 대한 이해를 심화할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 유사한 접근법40,41,42,43을 사용한 제브라피쉬 심장의 생체 내 연구와 대조적으로, 고급 LSM 기술과 조직 투명화 방법의 통합으로 설치류 모델 9,44를 이미징할 때 공간 해상도와 침투 깊이 사이의 문제를 극복할 수 있습니다. 조직 투명화 기술은 지질 및 기타 광 산란 요소를 제거하여 심장을 광학적으로 투명하게 만들어 더 깊은 이미징 침투를 가능하게 합니다45. LSM과 결합하면 심근을 영상화할 수 있습니다. 이 조합은 이미징 깊이를 향상시키고 복잡한 심근 미세 구조를 관찰할 수 있습니다. 수많은 투명화 방법(clearing method)이 확립되었지만18, 우리는 다른 조직 투명화 방법(15)과 비교하여 온전한 심장을 빠르게 투명하게 만들기 위해 iDISCO20을 채택하여 심근에서 자가형광 이미징에 쉽게 사용할 수 있도록 했습니다. 특정 형광 라벨링의 경우, 기존 iDISCO 및 Adipo-Clear46 프로토콜을 이 맞춤형 이미징 시스템에서 면역염색과 결합할 수 있습니다. 한편, 내인성 형광을 보존하고 더 짧은 처리 시간을 필요로 하는 방법이 제안된 연구에 선호됩니다. 다른 방법과 달리 이 플랫폼은 다음과 같은 이점을 제공합니다. 첫째, 조직 청소를 위해 조정된 iDISCO 프로토콜을 사용하여 심근 자가형광을 유지하면서 1주일 이내에 심장을 투명하게 빠르게 렌더링할 수 있습니다. 둘째, 이미지 스티칭(image stitching) 및 멀티뷰 디콘볼루션(multiview deconvolution)과 같은 계산 방법을 심장 이미징을 위한 이 확립된 라이트 시트 시스템에 통합합니다. 마지막으로, ASLM 시스템을 설계하고 동기화하여 대형 FOV에서 축 방향 해상도를 향상시킴으로써, 거의 등방성 해상도에서 심근 압박 및 섬유통과의 멀티스케일 이미징 및 분석을 가능하게 합니다.
설치류 모델의 심장 이미지를 캡처하기 위해 LSM을 기반으로 하는 네 가지 접근 방식, 즉 i) 스크리닝 목적의 기존 방법19, ii) 이미지 스티칭, iii) 멀티뷰 디콘볼루션 및 iv) ASLM 스캐닝을 제공했습니다. 모델에 따라 심장 크기가 다르다는 점을 고려하여, 공간 해상도, 획득 속도 및 FOV의 근본적인 절충안을 해결하고자 했습니다. 이미지 스티칭을 사용하면 공간 해상도가 저하된 대형 FOV를 사용할 수 있지만, 이를 멀티뷰 디콘볼루션 또는 ASLM과 결합하면 확장된 FOV에서 거의 등방성 해상도를 제공하여 전체 성인 마우스 심장을 커버할 수 있습니다. 또한 이러한 방법의 통합은 심부 조직의 이미지 품질과 대비를 향상시켜 심근 섬유주 및 심실 내부 압축과 같은 미세 구조의 3D 모델을 포괄적으로 디지털 재구성할 수 있습니다. 그러나 데이터 세트의 홍수, 광범위한 컴퓨팅 처리 비용, 정확한 이미지 등록의 필요성, 멀티뷰 디콘볼루션 및 이미징 스티칭에서 아티팩트가 발생할 가능성은 광범위한 응용 분야를 방해합니다. ASLM이 새로운 대안으로 떠오르고 있지만, 시스템 동기화의 복잡성, 레이저 스캐닝 전략 및 조직 투명도에 대한 의존도는 시스템 견고성에 영향을 미치고 심장의 사진 손상 위험을 증가시킬 수 있는 문제를 제기합니다.
LSM 이미징 및 조직 투명화를 포함한 이 방법론은 신생아에서 성인에 이르기까지 심장 구조를 탐구하기 위한 시작점을 제공합니다. 이는 심장 발달 중 특화된 심장 계통의 분포와 그 기능을 국소화할 수 있는 잠재력을 가지고 있다47. 심장 응용 분야 6,48,49,50,51,52,53에 맞춤화된 컴퓨터 분석의 개발로 이 프레임워크는 특히 심근 경색에 대한 반응으로 심장 리모델링 과정을 조사하도록 확장될 수 있습니다. 궁극적으로, 이 전체론적 전략은 심장 형태 형성의 근본적인 메커니즘을 밝히고 치료 개입의 개발을 촉진할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
동물 모델을 아낌없이 공유해 주신 UT Southwestern Medical Center의 Eric Olson 박사 그룹에 감사를 표합니다. UT Dallas의 D-incubator 회원들이 제공한 모든 건설적인 의견에 감사드립니다. 이 연구는 NIH R00HL148493(Y.D.), R01HL162635(Y.D.) 및 UT Dallas STARS 프로그램(Y.D.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | - | - | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 - 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
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