Summary
Dieses Protokoll zeigt die Chaperon-Aktivität des Hitzeschockproteins 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-Zellen dienen als Modell für den Assay, da sie ein natives, funktionell beeinträchtigtes Hsp70 beherbergen, was sie anfällig für Hitzestress macht. Die heterologe Einführung von funktionellem Hsp70 rettet die Wachstumsschwäche der Zellen.
Abstract
Hitzeschockprotein 70 (Hsp70) ist ein konserviertes Protein, das die Faltung anderer Proteine innerhalb der Zelle erleichtert und es zu einem molekularen Chaperon macht. Während Hsp70 für das Wachstum von E. coli-Zellen unter normalen Bedingungen nicht essentiell ist, wird dieses Chaperon für das Wachstum bei erhöhten Temperaturen unverzichtbar. Da Hsp70 hochkonserviert ist, besteht eine Möglichkeit, die Chaperonfunktion von Hsp70-Genen verschiedener Arten zu untersuchen, darin, sie heterolog in E. coli-Stämmen zu exprimieren, die entweder einen Mangel an Hsp70 aufweisen oder ein natives Hsp70 exprimieren, das funktionell beeinträchtigt ist. E. coli dnaK756-Zellen sind nicht in der Lage, λ-Bakteriophagen-DNA zu unterstützen. Darüber hinaus weist ihr natives Hsp70 (DnaK) eine erhöhte ATPase-Aktivität auf, während sie eine reduzierte Affinität zu GrpE (Hsp70-Nukleotidaustauschfaktor) aufweist. Infolgedessen wachsen E. coli dnaK756-Zellen bei Temperaturen zwischen 30 °C und 37 °C ausreichend, sterben jedoch bei erhöhten Temperaturen (>40 °C) ab. Aus diesem Grund dienen diese Zellen als Modell für die Untersuchung der Chaperonaktivität von Hsp70. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Anwendung dieser Zellen zur Durchführung eines Komplementationsassays, der die Untersuchung der In-Cellulo-Chaperon-Funktion von Hsp70 ermöglicht.
Introduction
Hitzeschockproteine spielen eine wichtige Rolle als molekulare Chaperone, indem sie die Proteinfaltung erleichtern, die Proteinaggregation verhindern und die Fehlfaltung von Proteinen umkehren 1,2. Das Hitzeschockprotein 70 (Hsp70) ist eines der bekanntesten molekularen Chaperone und spielt eine zentrale Rolle bei der Proteinhomöostase 3,4. DnaK ist das E. coli Hsp70-Homolog5.
Verschiedene biophysikalische, biochemische und zellbasierte Assays wurden entwickelt, um die Chaperon-Aktivität von Hsp70 zu untersuchen und nach Inhibitoren zu suchen, die auf dieses Chaperon abzielen 6,7,8. Hsp70 ist ein hochkonserviertes Protein. Aus diesem Grund wurde berichtet, dass mehrere Hsp70 eukaryotischer Organismen, wie Plasmodium falciparum (der Haupterreger der Malaria), die DnaK-Funktion in E. coliersetzen 6,9. Auf diese Weise wurde ein E. coli-basierter Komplementationsassay entwickelt, der die heterologe Expression von Hsp70s in E. coli beinhaltet, um ihre zytoprotektive Funktion zu untersuchen. Typischerweise beinhaltet dieser Assay die Verwendung von E. coli-Zellen, die entweder einen Mangel an DnaK aufweisen oder ein natives DnaK exprimieren, das funktionell beeinträchtigt ist. Während DnaK für das Wachstum von E. coli unter normalen Bedingungen nicht essentiell ist, wird es essentiell, wenn die Zellen unter Stressbedingungen wie erhöhten Temperaturen oder anderen Formen von Stress gezüchtet werden10,11.
Zu den E. coli-Stämmen, die entwickelt wurden, um die Funktion von Hsp70 mit einem Komplementationsassay zu untersuchen, gehören E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) und E. coli dnaK756. E. coli dnaK103-Zellen produzieren ein verkürztes DnaK, das nicht funktionsfähig ist, und als solches wachsen die Zellen bei 30 °C ausreichend, während der Stamm empfindlich auf Kälte- und Hitzestress reagiert12,13. Ebenso wächst der Stamm E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) nicht über 40 °C14,15. Der E. coli dnaK756-Stamm exprimiert ein mutiertes natives DnaK (DnaK756), das durch drei Glycin-Aspartat-Substitutionen an den Positionen 32, 455 und 468 gekennzeichnet ist, was zu beeinträchtigten proteostatischen Ergebnissen führt. Folglich ist dieser Stamm resistent gegen Bakteriophagen-λ-DNA14. Darüber hinaus weist E. coli dnaK756 eine erhöhte ATPase-Aktivität auf, während seine Affinität zum Nukleotidaustauschfaktor GrpE reduziert ist16. E. coli DnaK-Mutantenstämme dienen als ideale Modelle, um die Chaperonaktivität von Hsp70 durch einen Komplementationsansatz zu untersuchen. Da DnaK nur unter Stressbedingungen essentiell ist, wird der Komplementationsassay typischerweise bei erhöhten Temperaturen durchgeführt (Abbildung 1). Zu den Vorteilen der Verwendung von E. coli für diese Studie gehören das gut charakterisierte Genom, das schnelle Wachstum und die geringen Kosten für Kultivierung und Wartung17.
In diesem Artikel beschreiben wir detailliert ein Protokoll, bei dem E. coli dnaK756-Zellen verwendet werden, um die Funktion von Hsp70 zu untersuchen. Die Hsp70s, die wir im Assay verwendet haben, sind Wildtyp-DnaK und sein chimäres Derivat KPf (bestehend aus der ATPase-Domäne von DnaK, die mit der C-terminalen Substratbindungsdomäne von Plasmodium falciparum Hsp70-1 fusioniertist 6,18). KPf-V436F wurde heterolog als Negativkontrolle exprimiert, da die Mutation es im Wesentlichen daran hindert, Substrate zu binden, wodurch seine Chaperonaktivität aufgehobenwird 9.
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Protocol
1. Verwandlung
HINWEIS: Verwenden Sie sterile Glaswaren für Kulturen, Pipettenspitzen und frisch zubereitete und autoklavierte Medien. Bereiten Sie Kulturen der E. coli-Zellen in 2x Hefe-Trypton (YT) [1,6% Trypton (w/v), 1% Hefeextrakt (w/v), 0,5% NaCl (w/v), 1,5% Agar (w/v)] Agar vor. Allgemeine Reagenzien, die im Protokoll verwendet werden, und ihre Quellen sind in der Materialtabelle aufgeführt.
- 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen markieren und 50 μl kompetente E. coli dnaK756-Zellenaliquotieren, die Zellen auf Eis halten.
- In die 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit kompetenten Zellen aliquotieren Sie 10-50 ng pQE60/DnaK-, pQE60/KPf- und pQE60/KPf-V436F-Plasmid-DNA9 in separate Röhrchen.
- Bewahren Sie die 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit den kompetenten Zellen und der Plasmid-DNA 30 Minuten lang auf Eis auf.
- Die kompetente Zell-DNA-Mischung 60 s bei 42 °C hitzeschocken und die Mikrozentrifugenröhrchen für 10 min wieder auf Eis legen.
- 950 μl frische 2x YT-Bouillon (vorinkubiert bei 37 °C) zugeben und bei 37 °C unter Schütteln bei 150 Umdrehungen/min 1 h inkubieren. Lassen Sie die Zellen viel länger wachsen, um bei Bedarf ihre Erholung zu fördern.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Zellen kräftig zu schütteln. - Pipettieren Sie 100 μl der Zellen und verteilen Sie sie auf 2x YT-Agarplatten mit 50 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml Tetracyclin für den jeweiligen Stamm und 100 μg/ml Ampicillin (siehe Materialtabelle) für die Plasmidauswahl.
- Zentrifugieren Sie den Rest der Zellen (deren Volumen jetzt ca. 900 μl beträgt) 1 Minute lang bei 5000 x g (bei 4 °C) mit einer Tischmikrozentrifuge.
- Dekantieren Sie etwa 800 μl der Brühe und verwenden Sie das restliche Medium, um die pelletierten Zellen zu resuspendieren.
- Plattieren Sie die gewonnenen Zellen auf die 2x YT-Agarplatte.
- Beide Agarplatten über Nacht (oder ca. 17 h) bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Diese Zellen wachsen sehr langsam und müssen möglicherweise viel länger inkubiert werden. Achten Sie darauf, die Kolonien zu entdecken, die sehr klein beginnen können. Die Platte mit den nach der Zentrifugation (Schritt 1.7) resuspendierten Zellen dient als Backup für den Fall, dass die Transformationseffizienz der Zellen schlecht ist. In diesem Fall können die pelletierten Zellen die Rückgewinnung der transformierten Zellen verbessern. Wenn die Transformationseffizienz jedoch ausgezeichnet ist, kann die Agarplatte, auf der konzentrierte Zellen plattiert wurden, bei der Inkubation durch eine überwachsene Kultur gekennzeichnet sein, was die Identifizierung einzelner Kolonien erschwert. In diesem Fall kann die andere Agarplatte diejenige sein, auf der gut verteilte Kolonien wachsen.
2. Zellbeschichtung
- Nehmen Sie eine einzelne Kolonie aus den Transformanten und inokulieren Sie sie in 10 ml 2x YT-Bouillon, ergänzt mit 50 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml Tetracyclin für die Selektion der E. coli dnaK756-Zellen und 100 μg/ml Ampicillin für die Plasmidauswahl.
HINWEIS: Verwenden Sie Kolben (≥50 ml), um die Belüftung beim Rühren der Kultur sicherzustellen. Inkubieren Sie das Inokulum über Nacht (17 h) bei 37 °C unter Schütteln bei 150 Umdrehungen/min. - Nehmen Sie am nächsten Morgen eine Absorptionsmessung bei OD600 vor.
- Reinigen Sie die Oberfläche der Werkbank mit 75 % Ethanol, um die Oberfläche abzutupfen, um sie für die Zellfleckenbildung vorzubereiten.
- Standardisieren Sie die Kultur mit einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf einen OD600-Messwert von 2,0 mit 2x YT-Brühe.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die OD-Messwerte korrekt durchgeführt werden, da dieser Schritt für die Standardisierung der Zelldichte über die verschiedenen Proben hinweg wichtig ist. - Bereiten Sie mit 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen serielle Verdünnungen der Zellen von 100 bis 10-5 vor.
- Inkubieren Sie die Agarplatten, die zum Aufspießen der Zellen verwendet werden sollen, in einem Ofen bei 40 °C, damit die Platten bei teilweise geöffneten Deckeln trocknen können, um sicherzustellen, dass Wasserdampf entweicht.
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Zellen in gleichmäßig getrennten Abständen gefleckt werden, zeichnen Sie Linien auf ein Blatt Papier, auf das eine Vorlage mit Fleckenstellen gedruckt wird. - Spoten Sie 2 μl der seriell verdünnten Zellen auf die Agarplatten, ergänzt mit 50 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml Tetracyclin, 100 μg/ml Ampicillin und 0,5 mM IPTG (zur Induktion der Expression der rekombinanten Proteine) (siehe Materialtabelle).
- Jede Probe wird auf zwei separaten Platten aufgetragen (eine zur Inkubation bei 37 °C und die andere bei 43,5 °C).
Anmerkungen: Vermeiden Sie es, die Agarplatte zu durchstechen. - Kontrollproben auf derselben Platte wie die experimentellen Proben, um Umweltauswirkungen zu minimieren.
- Führen Sie die Schmierblutung schnell durch, um sicherzustellen, dass der Prozess abgeschlossen ist, bevor die Zellen zu wachsen beginnen, da dies zu verzerrten Wachstumsmustern führen kann.
HINWEIS: Es ist wichtig, beim Schmierbluten Aerosole zu vermeiden, da diese die Platten verunreinigen würden. Es ist auch wichtig, die Platten zwischen den Flecken geschlossen zu halten, um eine Kontamination zu vermeiden. - Eine Platte wird bei 37 °C (zulässige Wachstumstemperatur) und die andere bei der nicht zulässigen Wachstumstemperatur von 43,5 °C inkubiert.
HINWEIS: Inkubieren Sie die Platten mit dem Gesicht nach unten, um zu vermeiden, dass sich Dampf auf dem Deckel ansammelt, da das Kondenswasser die gefleckten Kolonien aus ihren Positionen spülen würde. - Legen Sie alle Platten gleichzeitig in die Inkubatoren und vermeiden Sie es, den Inkubator bis zum nächsten Morgen zu öffnen.
HINWEIS: Es wird davon abgeraten, die Inkubatortür während der Inkubation der Platten mehrmals zu öffnen. Denn der Zugang von Luft in den Inkubator kann zu Temperaturschwankungen führen, die sich negativ auf das Zellwachstum auswirken.
3. Bestätigung der Expression rekombinanter Proteine
- Entnehmen Sie mit einer sterilen Schleife einen Teil der verbleibenden Zellen aus derselben Kolonie transformierter E. coli dnaK756-Zellen.
- Impfen Sie die Zellen in 10 ml YT-Bouillon, ergänzt mit 50 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml Tetracyclin und 100 μg/ml Ampicillin. Über Nacht (17 h) bei 37 °C unter Schütteln bei 150 Umdrehungen/min inkubieren.
- Die Kultur wird in 90 ml sterile 2x YT-Bouillon überführt, die die erforderlichen Antibiotika enthält, wie in Schritt 3.2 beschrieben. Lassen Sie die Zellen bis zur mittleren Log-Phase wachsen (OD600 = 0,4-0,6).
- Entnehmen Sie 2 ml der Probenkultur vor der Induktion (0 h Induktionsprobe).
- Geben Sie IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zu, um die Proteinproduktion zu induzieren, und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C erneut.
- Entnehmen Sie 6 Stunden nach der Induktion eine zweite 2-ml-Probe.
- Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 5000 x g für 10 min. Halten Sie die Zentrifugentemperatur bei 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand.
- Das Pellet wird in PBS-Puffer (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4) resuspendiert und bei -20 °C gelagert.
4. SDS-PAGE und Western-Blot-Analysen
- Bereiten Sie 2x 10% SDS-Gele wie zuvor beschrieben19 vor.
- Bewahren Sie eines der SDS-PAGE-Gele für die anschließende Färbung mit Coomassie-Färbung auf, um die Proteinbanden anzuzeigen. Verwenden Sie das zweite SDS-PAGE-Gel, um eine Western-Blot-Analyse durchzuführen.
- Aliquotieren Sie 80 μl der resuspendierten Proben und mischen Sie sie mit 20 μl 4x Laemmli SDS-Ladepuffer.
- Die Suspension bei 100 °C 10 min kochen. Laden Sie dann 10 μl jeder Probe auf das vorgefertigte SDS-Gel (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie die Elektrophorese bei Raumtemperatur für 1 h mit einer Spannung von 120 V in einer 1x-Lösung von SDS-Laufpuffer (25 mm Tris, 250 mm Glycin, 0,1 % (w/v) SDS) durch.
- Färben Sie das Gel 1 h lang mit Coomassie-Färbung (siehe Materialtabelle), gefolgt von einer Entfärbung mit Entfärbungspuffer (50 % (v/v) Methanol, 10 % (v/v) Essigsäure in destilliertem Wasser) für 2 h.
- Visualisieren Sie die im Gel vorhandenen Proteinbanden mit einem Gel-Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle). Führen Sie ein weiteres SDS-PAGE-Gel mit denselben Proben gemäß dem oben genannten Protokoll erneut aus.
- Wenn der elektrophoretische Lauf endet, nehmen Sie SDS-PAGE-Gele, um eine Western-Blot-Analyse durchzuführen, wie zuvor beschrieben19.
- Waschen Sie die Nitrozellulosemembran, auf die die Proteine übertragen wurden, dreimal in Waschpuffer (TBS-Tween, pH 7,4 [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Tween]).
- Verwenden Sie α-DnaK (siehe Materialtabelle) zum Nachweis von DnaK und α-PfHsp70-17 zum Nachweis von KPf bzw. seiner Mutante KPf-V436F).
- Verwenden Sie die Antikörper in einer Verdünnung von 1:2000 in 5% fettfreier Milch. Inkubieren bei 4 °C unter Schütteln bei 60 Umdrehungen/min für 1 h.
- Entfernen Sie unspezifisch gebundene Antikörper, indem Sie die Nitrozellulosemembran in TBS-Tween 3 Mal in 15 min waschen.
- Inkubieren Sie die Membran im Sekundärantikörper (α-Kaninchen, siehe Materialtabelle) unter den gleichen Bedingungen wie im vorherigen Schritt. Es folgt das anschließende Waschen unter den gleichen Bedingungen wie der primäre Antikörper.
- Lösen Sie die Banden mit einem Reagenz zur Erkennung von verbesserter Chemilumineszenz (ECL) auf.
- Visualisieren Sie die Banden mit einem Gel-Imager.
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Representative Results
Abbildung 2 zeigt ein Bild des gescannten Agars mit Zellen, die bei der permissiven Wachstumstemperatur von 37 °C bzw. 43,5 °C gespottet und kultiviert wurden. Auf der rechten Seite von Abbildung 2 repräsentieren herausgeschnittene Western-Blot-Komponenten die Expression von DnaK, KPf und KPf-V436F in E. coli dnaK756-Zellen. Erwartungsgemäß konnten alle E. coli dnaK756-Zellen, die bei der permissiven Wachstumstemperatur von 37 °C kultiviert wurden, wachsen. Unter den nicht-permissiven Wachstumsbedingungen von 43,5 °C konnten jedoch nur Zellen wachsen, die heterolog DnaK und KPf exprimieren, wie bereits berichtet 6,9,20 (Abbildung 2). Auf der anderen Seite wuchsen Zellen, die KPf-V436F exprimierten, nur bei 37 °C, aber nicht bei 43,5 °C. Dies zeigt, dass DnaK und KPf in der Lage waren, den Wachstumsdefekt von E. coli dnaK756-Zellen unter Hitzestressbedingungen wiederherzustellen. Das Versagen von Zellen, die KPf-V436F heterolog exprimieren, das Wachstum von Zellen bei 43,5 °C zu unterstützen, zeigt die fehlende Chaperonfunktion dieses Proteins. In dieser Hinsicht dient KPf-V436F als ideales Negativkontrollprotein.
Abbildung 1: Prinzip des Komplementationsassays unter Verwendung von E. coli dnaK756-Zellen zur Untersuchung der Chaperonfunktion heterolog exprimierter Proteine. E. coli dnaK756 exprimiert ein natives DnaK756-Protein, das die Zellen nicht vor Hitzestress schützen kann. Die Einführung von funktionellem heterologem Hsp70 rettet die Zellen vor dem Tod bei Hitzestress. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Komplementationsplatten-Assay, der die Fähigkeiten von DnaK und KPf demonstriert, E . coli dnaK756-Zellen vor Hitzestress zu schützen. Die transformierten Zellen wurden bei 37 °C (permissive Wachstumstemperatur) und 43,5 °C (nicht-permissive Wachstumstemperatur) kultiviert. Die Zellen wurden standardisiert und als serielle Verdünnungen plattiert. "N" symbolisiert "ordentlich" und stellt den ersten Fleck dar, der aus unverdünnten Zellen besteht. Ganz rechts befinden sich die Western-Blot-Exzisionen, die die Expression der drei Proteine darstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das Protokoll demonstriert den Nutzen von E. coli dnaK756-Zellenbei der Erforschung der Chaperonfunktion von heterolog exprimiertem Hsp70. Dieser Assay könnte zum Screening von Inhibitoren eingesetzt werden, die auf die Hsp70-Funktion in Cellulo abzielen. Eine Einschränkung dieser Methode besteht jedoch darin, dass Hsp70s, die DnaK in E. coli nicht ersetzen können, mit diesem Assay nicht kompatibel sind. Das Fehlen einer posttranslationalen Modifikation21 einiger nicht-nativer Hsp70s könnte für ihre mangelnde Funktion innerhalb des E. coli-Systems verantwortlich sein. Ein hefebasierter Komplementationsassay22 kann einige der Mängel des E . coli-basierten Assays beheben.
Mehrere wichtige Schritte sind entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Dazu gehört, dass beim Plattieren nur Zellen verwendet werden, die durch das jeweilige Plasmidkonstrukt transformiert wurden. Darüber hinaus ist es wichtig, eine Kontamination der Kultur während der gesamten Schritte zu vermeiden. Da gestresste E. coli DnaK-Zellen anfällig für übermäßige Filamentierungsind 10, ist es außerdem wichtig, starkes Schütteln während der Kultur zu vermeiden, da diese physikalische Belastung eine ausgedehnte Filamentierung fördert. Übermäßig filamentierte Zellen liefern höhere falsche scheinbare Wachstumswerte bei OD600, was zu einer Überschätzung des Kulturwachstums führt und die Zellstandardisierung vor der Beschichtung beeinträchtigt. Obwohl Hsp70 für das Wachstum von E. coli unter normalen Bedingungen nicht essentiell ist, sind Zellen, denen dieses Protein fehlt, stressanfällig10. Aus diesem Grund wachsen E. coli dnaK756-Zellen nach der Transformation oder während ihrer Erholung aus Glycerinbeständen viel langsamer. Zudem reagieren sie extrem empfindlich auf Temperaturschwankungen. Daher ist es wichtig, das Öffnen der Inkubatortür zu vermeiden, sobald die plattierten Agarplatten hineingelegt wurden, bis es Zeit ist, die Platten zu betrachten.
Die Western-Blot-Daten sind wichtig, um die Expression der jeweiligen rekombinanten Hsp70-Proteine in E. coli dnaK756-Zellen zu bestätigen. Das Versäumnis, das jeweilige Protein zu exprimieren, führt zu einem falsch-negativen Ergebnis für Zellen, die unter nicht-permissiver Wachstumstemperatur wachsen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde mit Zuschüssen des International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) Fördernummer HDI/CRP/012, Forschungsdirektion der Universität Venda, Zuschuss I595, Department of Science and Innovation (DSI) und der National Research Foundation (NRF) von Südafrika (Fördernummern 75464 und 92598) unterstützt, die an AS vergeben wurden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
- Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
- Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Edkins, A. L., Boshoff, A. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. , Springer. (2021).
- Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
- Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
- Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
- Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
- Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).
- Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
- Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).
- Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
- Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
- Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
- Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
- Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
- Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
- Sato, S., Wilson, R. I.
- Shonhai, A. Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University. , Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007).
- Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).
- Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
- Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).
