열충격 단백질 70의 샤페론 기능을 연구하기 위한 대장균 기반 보완 분석

요약

이 프로토콜은 열 충격 단백질 70(Hsp70)의 샤페론 활성을 보여줍니다. 대장균 dnaK756 세포는 기능적으로 손상된 Hsp70을 가지고 있어 열 스트레스에 취약하기 때문에 분석의 모델 역할을 합니다. 기능성 Hsp70의 이종 도입은 세포의 성장 결핍을 구제합니다.

초록

열충격 단백질 70(Hsp70)은 세포 내에서 다른 단백질의 접힘을 촉진하여 분자 샤페론을 만드는 보존된 단백질입니다. Hsp70은 정상적인 조건에서 자라는 대장균 세포에 필수는 아니지만, 이 샤페론은 고온에서 자라는 데 없어서는 안 될 필수 요소입니다. Hsp70은 보존성이 높기 때문에 다양한 종의 Hsp70 유전자의 샤페론 기능을 연구하는 한 가지 방법은 Hsp70이 결핍되어 있거나 기능적으로 손상된 네이티브 Hsp70을 발현하는 대장균 균주에서 이질적으로 발현하는 것입니다. E. coli dnaK756 세포는 λ 박테리오파지 DNA를 지원할 수 없습니다. 또한, 그들의 네이티브 Hsp70(DnaK)은 GrpE(Hsp70 뉴클레오티드 교환 인자)에 대한 친화력이 감소하는 동안 상승된 ATPase 활성을 나타냅니다. 그 결과, 대장균 dnaK756 세포는 30°C에서 37°C 사이의 온도에서 적절하게 성장하지만 고온(>40°C)에서는 사멸합니다. 이러한 이유로, 이 세포들은 Hsp70의 샤페론 활성을 연구하기 위한 모델 역할을 합니다. 여기에서는 Hsp70의 셀룰로 샤페론 내 기능을 연구할 수 있는 보완 분석을 수행하기 위해 이러한 세포를 적용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

서론

열충격 단백질은 단백질 접힘을 촉진하고, 단백질 응집을 방지하며, 단백질 잘못 접힘을 역전시킴으로써 분자 샤페론으로서 중요한 역할을 합니다 ^1,2. 열충격 단백질 70(Hsp70)은 단백질 항상성 ^3,4에서 중심적인 역할을 하는 가장 두드러진 분자 샤페론 중 하나입니다. DnaK는 대장균 Hsp70 상동체⁵입니다.

Hsp70의 샤페론 활성을 탐구하고 이 샤페론 ^6,7,8을 표적으로 하는 억제제를 스크리닝하기 위해 다양한 생물물리학적, 생화학적, 세포 기반 분석법이 개발되었습니다. Hsp70은 고도로 보존된 단백질입니다. 이러한 이유로, Plasmodium falciparum(말라리아의 주성분)과 같은 진핵 생물의 여러 Hsp70이 대장균 ^6,9

프로토콜

1. 변환

알림: 배양, 피펫 팁 및 새로 준비되고 고압멸균된 배지에는 멸균 유리 용기를 사용하십시오. 2x 효모 트립톤(YT)[1.6% 트립톤(w/v), 1% 효모 추출물(w/v), 0.5% NaCl(w/v), 1.5% 한천(w/v)] 한천에서 대장균 세포의 배양을 준비합니다. 프로토콜에 사용되는 일반 시약 및 그 출처는 재료 표에 나와 있습니다.

1. 2.0mL 미세 원심분리기 튜브에 라벨을 붙이고 50μL의 유능한 대장균 dnaK756세포를 분취하여 세포를 얼음 상태로 유지합니다.
2. 유능한 세포가 있는 2.0mL 마이크로 원심분리기 튜브에 pQE60/DnaK, pQE60/KPf 및 pQE60/KPf-V436F 플라스미드 DNA⁹를 10-50ng 분취합니다.
3. 유능한 세포와 플라스미드 DNA가 들어 있는 2.0mL 미세 원심분리기 튜브를 얼음 위에 30분 동안 보관합니다.
4. 유능한 세포-DNA 혼합물을 42°C에서 60초 동안 열충격하고 마이크로 원심분리기 튜브를 다시 얼음 위에 10분 동안 되돌립니다.
5. 950μL의 신선한 2x....

결과

그림 2는 각각 37°C 및 43.5°C의 허용 성장 온도에서 발견 및 배양된 세포를 포함하는 스캔된 한천의 이미지를 보여줍니다. 그림 2의 오른쪽에서 절제된 웨스턴 블롯 성분은 E. coli dnaK756 세포에서 DnaK, KPf 및 KPf-V436F의 발현을 나타냅니다. 예상대로, 37°C의 허용 성장 온도에서 배양된 모든 대장균 dnaK756 세포는 성장할 수 있었습니다. 그러나 43.5°C의 비허용 성장 조건에서는 이전에 보고된^바와 같이 DnaK 및 KPf를 이질적으로 발현하는 세포만 성장할 수 ^{있었습니다(}그림 2). 반면, KPf-V436F를 발현하는 세포는 37.......

토론

이 프로토콜은 이질적으로 발현된 Hsp70의 샤페론 기능을 탐색하는 데 있어 E. coli dnaK756세포의 유용성을 보여줍니다. 이 분석법은 셀룰로에서 Hsp70 기능을 표적으로 하는 억제제를 스크리닝하는 데 채택될 수 있습니다. 그러나 이 방법의 한 가지 한계는 대장균 에서 DnaK를 대체할 수 없는 Hsp70이 이 분석법과 호환되지 않는다는 것입니다. 일부 non-native Hsp70의 번역후 변형(post-translational modification)²¹의 부족은 대장균 시스템 내에서 기능의 부족을 설명할 수 있다. 효모 기반 보완 분석법⁽²²)은 대장균 기반 분석법의 일부 단점을 해결할 수 있다.

재현 가능한 결과를 보장하기 위해서는 몇 가지 주요 단계가 중요합니다. 여기에는 도금 중에 각각의 플라스.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	샘플 로딩 염료
구성 요소 아세트산	Labchem	101005125	destainer
아크릴아미드	Sigma-Aldrich	8008300100	구성 요소 SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	구성
Agarose	Clever Scientific	14131031	인증 분자 생물학 아가로스
과황산 암모늄	시그마-알드리치	101875295	SDS-PAGE 젤
Ampicillin	VWR International	0339—EU— 25G	선택적 항생제
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	SDS
Bromophenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	구성 요소 샘플 로딩 염료
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	유능한 세포 준비용
Coomassie brilliant blue	VWR International	443293X	SDS-PAGE 염료
이염기성 인산나트륨	시그마-알드리치	RB10368	PBS 완충액의 구성 요소
ECL	Thermofischer Scientific	32109	웨스턴 블롯 검출 시약
Ethidium Bromide	Thermofischer Scientific	17898	DNA 삽입 염료
글리세롤	Merck	SAAR2676520L	샘플 로딩 염료 Glycine 구성 성분
	VWR International	10119CU	SDS
IPTG	Glentham 생명 과학 구성 요소	162IL	유도제
Kanamycin	Melford	K0126	선택적 항생제
염화 마그네슘	Merck	SAAR4123000EM	매체 및 액체 성장 분석의 구성
메탄올	Labchem	113140129	destainer
일염기성 인산칼륨	Merck	1,04,87,30,250	PBS 완충액의 구성
펩톤	Merck	HG000BX4.250	매체 및 액체 성장 분석의 구성
염화칼	Merck	SAAR5042020EM	PBS 완충액의 구성
PVDF 멤브레인	Thermofischer scientific	PB7320	웨스턴 블롯 멤브레인
염화나트륨	Merck	SAAR5822320EM	매체 및 액체 성장 분석의 구성 요소
나트륨 도데 실 황산염	VWR 국제	108073	발현 단백질을 해결하기 위해
Spectramax iD3	분리	373705019	자동 플레이트 리더
TEMED	VWR 국제	ACRO420580500	SDS 젤
Tetracycline	Duchefa Biochemies의 구성 요소	T0150.0025	선택적 항생제
Tris	VWR International	19A094101	SDS 젤
Tween20	구성 요소 Merck	SAAR3164500XF	Constituent for Western wash buffer
Western Transfer chamber	Thermofisher Scientific	PB0112	단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 이동
효모 추출물	Merck	HG000BX6.500	매체 및 액체 성장 분석의 구성
요소&알파;-DnaK 항체	Inqaba	BK CAC09317	1차 항체
&알파;-토끼 항체	Thermofischer scientific	31460	2차 항체

요소 요소 의 구성 요소 요소 성분 륨 요소