Summary
该方案证明了热休克蛋白70（Hsp70）的伴侣活性。 大肠杆菌 dnaK756 细胞可作为测定的模型，因为它们含有天然的、功能受损的 Hsp70，使其容易受到热应激的影响。功能性 Hsp70 的异源引入挽救了细胞的生长缺陷。
Abstract
热休克蛋白 70 （Hsp70） 是一种保守的蛋白质，可促进细胞内其他蛋白质的折叠，使其成为分子伴侣。虽然 Hsp70 对于在正常条件下生长的大 肠杆菌 细胞不是必需的，但这种伴侣对于在高温下生长是必不可少的。由于 Hsp70 是高度保守的，因此研究来自不同物种的 Hsp70 基因伴侣功能的一种方法是在大肠杆菌菌株中异源表达它们，这些 菌 株要么缺乏 Hsp70，要么表达功能受损的天然 Hsp70。 大肠杆菌 dnaK756 细胞不能支持噬菌体 DNA。此外，它们的天然 Hsp70 （DnaK） 表现出升高的 ATP 酶活性，同时表现出对 GrpE（Hsp70 核苷酸交换因子）的亲和力降低。因此， 大肠杆菌 dnaK756 细胞在 30 °C 至 37 °C 的温度范围内充分生长，但它们在高温 （>40 °C） 下死亡。出于这个原因，这些细胞可作为研究 Hsp70 伴侣活性的模型。在这里，我们描述了应用这些细胞进行互补测定的详细方案，从而能够研究 Hsp70 的纤维素 伴侣功能。
Introduction
热休克蛋白通过促进蛋白质折叠、防止蛋白质聚集和逆转蛋白质错误折叠，发挥着分子伴侣的重要作用 1,2。热休克蛋白 70 （Hsp70） 是最突出的分子伴侣之一，在蛋白质稳态中起着核心作用 3,4。DnaK 是大肠杆菌 Hsp70 同源物5。
已经开发了各种生物物理、生化和基于细胞的测定法来探索 Hsp70 的伴侣活性并筛选靶向该伴侣的抑制剂 6,7,8。Hsp70 是一种高度保守的蛋白质。出于这个原因，据报道，几种真核生物的 Hsp70，例如恶性疟原虫（疟疾的主要病原体）可替代大肠杆菌中的 DnaK 功能 6,9。通过这种方式，开发了一种基于大肠杆菌的互补测定法，涉及大肠杆菌中Hsp70s的异源表达，以探索其细胞保护功能。通常，该测定涉及利用缺乏 DnaK 或表达功能受损的天然 DnaK 的大肠杆菌细胞。虽然DnaK在正常条件下对大肠杆菌的生长不是必需的，但当细胞在高温或其他形式的压力等压力条件下生长时，它变得至关重要10,11。
使用互补测定法研究 Hsp70 功能的大肠杆菌菌株包括大肠杆菌 dnaK103 （BB2393 [C600 dnaK103（Am） thr：：Tn10]） 和大肠杆菌 dnaK756。大肠杆菌 dnaK103 细胞产生无功能的截短 DnaK，因此，细胞在 30 °C 下充分生长，而菌株对冷和热应激敏感12,13。同样，大肠杆菌 dnaK756/BB2362 （dnaK756 recA：：TcR Pdm1,1） 菌株不会在 40 °C以上生长 14,15。大肠杆菌 dnaK756 菌株表达突变的天然 DnaK （DnaK756），其特征是在 32、455 和 468 位点有三种甘氨酸到天冬氨酸的取代，导致蛋白稳态结果受损。因此，该菌株对噬菌体λ DNA14具有抗性。此外，大肠杆菌 dnaK756 表现出升高的 ATP 酶活性，而其对核苷酸交换因子 GrpE 的亲和力降低16。大肠杆菌DnaK突变菌株可作为通过互补方法研究Hsp70伴侣活性的理想模型。由于 DnaK 仅在压力条件下是必需的，因此互补测定通常在高温下进行（图 1）。使用大肠杆菌进行这项研究的一些优点包括其表征良好的基因组、快速生长以及培养和维护的低成本17。
在本文中，我们详细描述了一种涉及使用大肠杆菌 dnaK756 细胞来研究 Hsp70 功能的方案。我们在测定中使用的 Hsp70 是野生型 DnaK 及其嵌合衍生物 KPf（由 DnaK 的 ATP 酶结构域与恶性疟原虫 Hsp70-1 6,18 的 C 端底物结合结构域融合组成）。KPf-V436F 被异源表达为阴性对照，因为该突变基本上阻止其结合底物，从而消除其伴侣活性9。
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Protocol
1. 转型
注意：使用无菌玻璃器皿进行培养、移液器吸头以及新鲜制备和高压灭菌的培养基。在2x酵母胰蛋白胨（YT）[1.6%胰蛋白胨（w / v），1%酵母提取物（w / v），0.5%NaCl（w / v），1.5%琼脂（w / v）]琼脂中制备 大肠杆菌 细胞的培养物。协议中使用的一般试剂及其来源在 材料表中提供。
- 标记 2.0 mL 微量离心管并等分试样 50 μL 感受态大肠杆菌 dnaK756细胞，将细胞保持在冰上。
- 将 10-50 ng pQE60/DnaK、pQE60/KPf 和 pQE60/KPf-V436F 质粒DNA 9 等分装到具有感受态细胞的 2.0 mL 微量离心管中。
- 将含有感受态细胞和质粒 DNA 的 2.0 mL 微量离心管在冰上保存 30 分钟。
- 在42°C下将感受态细胞 - DNA混合物热休克60秒，并将微量离心管放回冰上10分钟。
- 加入950μL新鲜的2x YT肉汤（在37°C下预孵育），并在37°C下孵育，同时以150转/分钟振荡1小时。如有必要，让细胞生长更长时间以促进其恢复。
注意：避免剧烈摇晃细胞。 - 移液 100 μL 细胞并将它们铺布到 2x YT 琼脂平板上，其中含有 50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 用于相应菌株的四环素和 100 μg/mL 氨苄青霉素（参见 材料表）用于质粒选择。
- 使用台式微量离心机将其余细胞（其体积现在约为900μL）在5000× g （4°C下）离心1分钟。
- 倒出约 800 μL 肉汤，并使用剩余的培养基重悬沉淀细胞。
- 将回收的细胞铺板到2x YT琼脂平板上。
- 将两个琼脂平板在37°C下孵育过夜（或约17小时）。
注意：这些细胞生长非常缓慢，可能需要孵育更长时间。小心发现可能开始时非常小的菌落。含有离心后重悬的细胞的板（步骤1.7）作为备份，以防细胞的转化效率较差，在这种情况下，沉淀的细胞可以提高任何转化细胞的回收率。然而，如果转化效率极好，则在孵育时，将浓缩细胞接种在琼脂平板上的培养物可能过度生长，从而难以识别单个菌落。在这种情况下，另一个琼脂平板可能是生长间隔良好的菌落的平板。
2. 电芯电镀
- 从转化体中取出一个菌落，并将其接种到 10 mL 的 2x YT 肉汤中，该肉汤补充有 50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 四环素用于选择 大肠杆菌 dnaK756 细胞，以及 100 μg/mL 氨苄青霉素用于质粒选择。
注意：在搅拌培养物时，使用烧瓶（≥50 mL）确保曝气。将接种物在37°C下孵育过夜（17小时），同时以150转/分钟振荡。 - 第二天早上在OD600下测量吸光度读数。
- 使用 75% 乙醇清洁工作台表面，擦拭表面，为细胞斑点做准备。
- 使用 2 mL 微量离心管，使用 2x YT 肉汤将培养物标准化至 OD600 读数为 2.0。
注意：确保正确获取 OD 读数，因为此步骤对于标准化各种样品的细胞密度非常重要。 - 使用2mL微量离心管，制备从100到10-5的细胞的连续稀释液。
- 在40°C的烘箱中孵育用于点细胞的琼脂平板，以使平板干燥，盖子部分打开，以确保水蒸气逸出。
注意：为确保以均匀的间隔距离发现细胞，请在一张纸上画线，并在该纸上打印斑点位点模板。 - 将2μL连续稀释的细胞点到补充有50μg/ mL卡那霉素，10μg/ mL四环素，100μg/ mL氨苄青霉素和0.5mM IPTG（用于诱导重组蛋白表达）的琼脂平板上（参见 材料表）。
- 将每个样品点在两个单独的板上（一个在37°C下孵育，另一个在43.5°C下孵育）。
注意：避免刺穿琼脂平板。 - 将对照样品点在与实验样品相同的平板上，以尽量减少对环境的影响。
- 快速进行点样检查，以确保在细胞开始生长之前完成该过程，因为这可能会产生扭曲的生长模式。
注意： 发现时避免气溶胶很重要，因为气溶胶会污染板。在点滴之间保持板关闭以避免污染也很重要。 - 将一块板在37°C（允许生长温度）下孵育，另一块板在43.5°C的非允许生长温度下孵育。
注意：将板倒置孵育以避免蒸汽积聚到盖子上，因为冷凝水会将斑点菌落从其位置上冲走。 - 将所有板同时放入培养箱中，避免在第二天早上打开培养箱。
注意：在培养板孵育期间，不鼓励多次打开培养箱门。这是因为空气进入培养箱可能会导致温度波动，从而对细胞生长产生不利影响。
3. 确认重组蛋白的表达
- 使用无菌环，从转化的大 肠杆菌 dnaK756 细胞的同一菌落中取出部分剩余细胞。
- 将细胞接种到补充有 50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 四环素和 100 μg/mL 氨苄青霉素的 10 mL YT 肉汤中。在37°C下孵育过夜（17小时），同时以150转/分钟振荡。
- 如步骤3.2所述，将培养物转移到含有必要抗生素的90 mL无菌2x YT肉汤中。让细胞生长到中期对数期（OD600 = 0.4-0.6）。
- 诱导前取 2 mL 样品培养物（诱导样品 0 小时）。
- 加入IPTG至终浓度为1mM以诱导蛋白质产生，并在37°C下重新孵育细胞。
- 诱导后 6 小时取第二个 2 mL 样品。
- 通过以5000× g 离心10分钟来收获细胞。将离心机温度保持在4°C。
- 弃去上清液。
- 将沉淀重悬于PBS缓冲液（137mM NaCl，27mM KCl，4.3mM Na2HPO 4,1.4mM KH 2PO4）中并储存在-20°C。
4. SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
- 如前所述制备 2x 10% SDS 凝胶19.
- 保留其中一种SDS-PAGE凝胶，以便随后使用考马斯染色剂进行染色，以查看蛋白条带。使用第二种SDS-PAGE凝胶进行蛋白质印迹分析。
- 将 80 μL 重悬样品等分，并与 20 μL 4x Laemmli SDS 上样缓冲液混合。
- 将悬浮液在100°C煮沸10分钟。然后将每个样品的 10 μL 加载到预制 SDS 凝胶上（参见 材料表）。
- 在室温下使用120V的电压在SDS运行缓冲液（25mmTris，250mm甘氨酸，0.1%（w / v）SDS）的1x溶液中进行电泳1小时。
- 用考马斯染色剂（参见 材料表）染色凝胶1小时，然后使用脱色缓冲液（50%（v / v）甲醇，10%（v / v）乙酸在蒸馏水中）脱色2小时。
- 使用凝胶成像系统可视化凝胶中存在的蛋白质条带（参见 材料表）。按照上述方案，用相同的样品重新运行另一个SDS-PAGE凝胶。
- 当电泳运行结束时，取SDS-PAGE凝胶进行蛋白质印迹分析，如前所述19。
- 在洗涤缓冲液（TBS-吐温，pH 7.4 [50 mM Tris，150 mM NaCl，1% （v / v）吐温]）中洗涤蛋白质转移到其上的硝酸纤维素膜。
- 分别使用α-DnaK（参见 材料表）检测DnaK和α-PfHsp70-17检测KPf及其突变体KPf-V436F）。
- 在 5% 脱脂牛奶中以 1：2000 的稀释度使用抗体。在4°C孵育，同时以60转/分钟振荡1小时。
- 通过在 15 分钟内洗涤 TBS-Tween 中的硝酸纤维素膜 3 次来去除非特异性结合的抗体。
- 在与上一步相同的条件下，在二抗（α-兔，参见 材料表）中孵育膜。随后在与一抗相同的条件下进行洗涤。
- 使用增强型化学发光 （ECL） 检测试剂解析条带。
- 使用凝胶成像仪可视化条带。
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Representative Results
图2显示了分别在37°C和43.5°C的允许生长温度下发现和培养的含有细胞的扫描琼脂的图像。在图 2 的右侧，切除的蛋白质印迹成分代表大肠杆菌 dnaK756 细胞中 DnaK、KPf 和 KPf-V436F 的表达。正如预期的那样，在37°C的允许生长温度下培养的所有大肠杆菌dnaK756细胞都成功生长。然而，在43.5°C的非允许生长条件下，只有异源表达DnaK和KPf的细胞能够生长，如先前报道的6,9,20（图2）。另一方面，表达KPf-V436F的细胞仅在37°C下生长，但在43.5°C下无法生长。 这表明DnaK和KPf能够在热应激条件下恢复大肠杆菌dnaK756细胞的生长缺陷。异源表达KPf-V436F的细胞在43.5°C下无法支持细胞的生长，这表明该蛋白缺乏伴侣功能。在这方面，KPf-V436F是一种理想的阴性对照蛋白。
图 1：使用 大肠杆菌 dnaK756 细胞研究异源表达蛋白的伴侣功能的互补试验原理。 大肠杆菌 dnaK756 表达一种天然 DnaK756 蛋白，该蛋白无法保护细胞免受热应激。引入功能性异源 Hsp70 可使细胞免于暴露于热应激时死亡。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：互补板测定，证明 DnaK 和 KPf 保护 大肠杆菌 dnaK756 细胞免受热应激的能力。 转化的细胞在37°C（允许生长温度）和43.5°C（非允许生长温度）下培养。将细胞标准化并接种为连续稀释液。“N”表示“整洁”，代表由未稀释的细胞组成的第一个点。最右边是蛋白质印迹切除，代表三种蛋白质的表达。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该方案证明了 大肠杆菌 dnaK756细胞在探索异源表达的 Hsp70 的伴侣功能方面的效用。该测定可用于筛选 纤维素中靶向 Hsp70 功能的抑制剂。然而，该方法的一个局限性是，在大 肠杆菌 中不能替代 DnaK 的 Hsp70 与该测定不兼容。一些非天然 Hsp70 缺乏翻译后修饰21 可能是它们在 大肠杆菌 系统中缺乏功能的原因。基于酵母的互补测定22可以解决基于 大肠杆菌的测定的一些缺点。
几个关键步骤对于确保结果的可重复性至关重要。这些包括确保在接种过程中仅使用由相应质粒构建体转化的细胞。此外，在整个步骤中避免培养物污染也很重要。此外，由于应激 的大肠杆菌 DnaK 细胞容易受到过度细丝的影响 10，因此在培养过程中避免剧烈摇晃很重要，因为这种物理应变会促进广泛的细丝化。在OD600时，过度细丝的细胞会给出更高的假表观生长读数，导致培养物生长被高估，并在铺板前对细胞标准化产生不利影响。尽管 Hsp70 在正常条件下对 大肠杆菌 的生长不是必需的，但缺乏这种蛋白质的细胞对应激敏感10。因此， 大肠杆菌 dnaK756 细胞在转化后或从甘油储备中回收过程中生长速度要慢得多。此外，它们对温度波动极为敏感。因此，重要的是，一旦将铺板琼脂平板放入其中，就要避免打开培养箱门，直到需要查看平板。
蛋白质印迹数据对于确认 大肠杆菌 dnaK756 细胞中相应重组 Hsp70 蛋白的表达非常重要。未能表达相应的蛋白质会导致在非允许生长温度下生长的细胞出现假阴性结果。
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Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国际遗传工程和生物技术中心（ICGEB）资助号HDI/CRP/012，文达大学研究理事会，资助I595，科学与创新部（DSI）和南非国家研究基金会（NRF）的资助（资助号，75464和92598）授予AS。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
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