Summary
Этот протокол демонстрирует шаперонную активность белка теплового шока 70 (Hsp70). Клетки E. coli dnaK756 служат моделью для анализа, поскольку они содержат нативный, функционально ослабленный Hsp70, что делает их восприимчивыми к тепловому стрессу. Гетерологичное введение функционального Hsp70 спасает дефицит роста клеток.
Abstract
Белок теплового шока 70 (Hsp70) является консервативным белком, который способствует сворачиванию других белков в клетке, что делает его молекулярным шапероном. В то время как Hsp70 не является необходимым для клеток E. coli , растущих в нормальных условиях, этот шаперон становится незаменимым для роста при повышенных температурах. Поскольку Hsp70 обладает высокой консервативностью, одним из способов изучения шаперонной функции генов Hsp70 различных видов является их гетерологическая экспрессия в штаммах E. coli , которые либо испытывают дефицит Hsp70, либо экспрессируют нативный Hsp70, который функционально скомпрометирован. Клетки E. coli dnaK756 не способны поддерживать λ ДНК бактериофага. Кроме того, их нативный Hsp70 (DnaK) проявляет повышенную активность АТФазы, демонстрируя при этом пониженное сродство к GrpE (фактор нуклеотидного обмена Hsp70). В результате клетки E. coli dnaK756 адекватно растут при температуре от 30 °C до 37 °C, но погибают при повышенных температурах (>40 °C). По этой причине эти клетки служат моделью для изучения шаперонной активности Hsp70. Здесь мы опишем подробный протокол применения этих клеток для проведения анализа комплементации, позволяющего изучить функцию шаперона в целлюлоне Hsp70.
Introduction
Белки теплового шока играют важную роль в качестве молекулярных шаперонов, облегчая сворачивание белков, предотвращая агрегацию белков и обращая вспять неправильное сворачивание белков 1,2. Белок теплового шока 70 (Hsp70) является одним из наиболее известных молекулярных шаперонов, играющих центральную роль в белковом гомеостазе 3,4. DnaK является гомологом E. coli Hsp705.
Различные биофизические, биохимические и клеточные анализы были разработаны для изучения активности шаперона Hsp70 и скрининга ингибиторов, нацеленных на этот шаперон 6,7,8. Hsp70 является высококонсервативным белком. По этой причине сообщалось, что несколько Hsp70 эукариотических организмов, таких как Plasmodium falciparum (основной возбудитель малярии), замещают функцию DnaK у E. coli 6,9. Таким образом, был разработан анализ комплементации на основе E. coli, включающий гетерологичную экспрессию Hsp70 у E. coli для изучения их цитопротекторной функции. Как правило, этот анализ включает в себя использование клеток E. coli, которые либо испытывают дефицит ДНКК, либо экспрессируют нативный ДНКК, который функционально скомпрометирован. В то время как ДНКК не является необходимым для роста кишечной палочки в нормальных условиях, она становится необходимой, когда клетки выращиваются в стрессовых условиях, таких как повышенные температуры или другиеформы стресса.
Штаммы E. coli, которые были разработаны для изучения функции Hsp70 с помощью анализа комплементации, включают E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) и E. coli dnaK756. Клетки E. coli dnaK103 продуцируют усеченный DnaK, который не функционирует, и поэтому клетки адекватно растут при 30 °C, в то время как штамм чувствителен к холоду и тепловому стрессу12,13. Аналогично, штамм E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) не поднимается выше 40 °C14,15. Штамм E. coli dnaK756 экспрессирует мутантный нативный DnaK (DnaK756), характеризующийся тремя заменами глицина на аспартат в положениях 32, 455 и 468, что приводит к нарушенным протеостатическим результатам. Следовательно, этот штамм устойчив к бактериофагу λ ДНК14. Кроме того, E. coli dnaK756 проявляет повышенную активность АТФазы, в то время как ее сродство к фактору нуклеотидного обмена, GrpE, снижено16. Кишечная палочка Мутантные штаммы DnaK служат идеальными моделями для исследования активности шаперона Hsp70 с помощью комплементационного подхода. Поскольку ДНКК необходим только в стрессовых условиях, анализ комплементации обычно проводится при повышенных температурах (рис. 1). Некоторые преимущества использования E. coli для этого исследования включают ее хорошо охарактеризованный геном, быстрый рост и низкую стоимость культивирования и содержания17.
В этой статье мы подробно опишем протокол, предполагающий использование клеток E. coli dnaK756 для изучения функции Hsp70. Hsp70, которые мы использовали в анализе, представляют собой DnaK дикого типа и его химерное производное KPf (состоящее из АТФазного домена DnaK, слитого с С-концевым субстрат-связывающим доменом Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F был гетерологически экспрессирован как отрицательный контроль, поскольку мутация, по сути, блокирует его от связывания субстратов, тем самым отменяя его шаперонную активность9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Трансформация
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильную стеклянную посуду для закваскивания, наконечники пипеток и свежеприготовленные и автоклавные среды. Приготавливают культуры клеток E. coli в 2х дрожжевых триптоне (YT) [1,6% триптон (w/v), 1% экстракт дрожжей (w/v), 0,5% NaCl (w/v), 1,5% агар (w/v)] агаре. Общие реактивы, используемые в протоколе, и их источники приведены в Таблице материалов.
- Маркируют пробирки для микроцентрифуг объемом 2,0 мл и аликвотируют 50 мкл компетентных клеток E. coli dnaK756, удерживая клетки на льду.
- В пробирки микроцентрифуг объемом 2,0 мл с компетентными клетками в отдельные пробирки помещают 10-50 нг плазмидной ДНК9 pQE60/DnaK, pQE60/KPf и pQE60/KPf-V436F.
- Пробирки микроцентрифуги объемом 2,0 мл, содержащие компетентные клетки и плазмидную ДНК, держать на льду в течение 30 минут.
- Подвергают тепловому шоку компетентную смесь клеток и ДНК в течение 60 с при 42 °C и возвращают пробирки микроцентрифуг обратно на лед в течение 10 минут.
- Добавьте 950 мкл свежего бульона 2x YT (предварительно инкубированного при 37 °C) и инкубируйте при 37 °C, встряхивая при 150 оборотах/мин в течение 1 ч. Оставьте клетки расти гораздо дольше, чтобы стимулировать их восстановление в случае необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте сильного встряхивания клеток. - Пипетку 100 мкл клеток и распределите их на 2 пластины из агара YT, содержащие 50 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина для соответствующего штамма и 100 мкг/мл ампициллина (см. таблицу материалов) для выбора плазмиды.
- Центрифугируйте остальные ячейки (объем которых теперь составляет примерно 900 мкл) в течение 1 мин при 5000 x g (при 4 °C) с помощью настольной микроцентрифуги.
- Сцедите около 800 мкл бульона и используйте оставшуюся среду для ресуспендирования гранулированных клеток.
- Выложите восстановленные клетки на пластину с агаром 2x YT.
- Инкубируйте обе пластины с агаром в течение ночи (или примерно 17 ч) при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки растут очень медленно и, возможно, нуждаются в инкубации в течение гораздо более длительного времени. Будьте осторожны, чтобы заметить колонии, которые могут быть очень маленькими. Пластина, содержащая ресуспендированные клетки после центрифугирования (шаг 1.7), служит резервом на случай, если эффективность трансформации клеток будет низкой, и в этом случае гранулированные клетки могут улучшить восстановление любых трансформированных клеток. Однако, если эффективность трансформации превосходна, агаровая пластина, на которую были нанесены концентрированные клетки, может характеризоваться разросшейся культурой при инкубации, что затрудняет идентификацию одиночных колоний. В этом случае другая агаровая пластина может быть той, на которой растут хорошо расположенные колонии.
2. Покрытие ячеек
- Возьмите одну колонию из трансформантов и инокулируйте ее в 10 мл бульона 2x YT с добавлением 50 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина для отбора клеток E. coli dnaK756 и 100 мкг/мл ампициллина для выбора плазмиды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте колбы (≥50 мл) для обеспечения аэрации при перемешивании культуры. Инкубируйте посевной материал в течение ночи (17 ч) при температуре 37 °C, встряхивая со скоростью 150 оборотов/мин. - На следующее утро измерьте коэффициент поглощения при OD600.
- Очистите поверхность верстака, используя 75% этанол, чтобы промыть поверхность для подготовки к обнаружению пятен на клетках.
- Используя пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл, стандартизируйте культуру до показателя OD600 2,0, используя бульон 2x YT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что показания наружного диаметра сняты правильно, так как этот шаг важен для стандартизации плотности ячеек в различных образцах. - Используя пробирки микроцентрифуги объемом 2 мл, готовят последовательные разведения клеток от 100 до 10-5.
- Инкубируйте агаровые пластины, которые будут использоваться для размещения клеток, в духовке, установленной при температуре 40 °C, чтобы дать пластинам высохнуть, с частично открытыми крышками, чтобы обеспечить выход водяного пара.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что ячейки находятся на равномерном расстоянии друг от друга, нарисуйте линии на листе бумаги, на котором будет напечатан шаблон пятнистых участков. - Нанесите 2 мкл последовательно разбавленных клеток на агаровые пластины, добавив 50 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, 100 мкг/мл ампициллина и 0,5 мМ IPTG (для индукции экспрессии рекомбинантных белков) (см. таблицу материалов).
- Поместите каждый образец на две отдельные чашки (одну для инкубации при 37 °C, а другую при 43,5 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прокалывания агаровой пластины. - Размещайте контрольные образцы на той же пластине, что и экспериментальные образцы, чтобы свести к минимуму воздействие на окружающую среду.
- Проводите пятнистость быстро, чтобы убедиться, что процесс завершен до того, как клетки начнут расти, так как это может привести к искажению моделей роста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать аэрозолей при пятнах, так как они могут загрязнить пластины. Также важно держать пластины закрытыми в промежутках между пятнами, чтобы избежать загрязнения. - Инкубируйте одну чашку при 37 °C (допустимая температура роста), а другую при недопускающей температуре роста 43,5 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубируйте пластины вверх дном, чтобы избежать скопления пара на крышке, так как конденсированная вода смоет пятнистые колонии с их позиций. - Поместите все тарелки в инкубаторы одновременно и не открывайте инкубатор до следующего утра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется открывать дверцу инкубатора несколько раз во время инкубации планшетов. Это связано с тем, что доступ воздуха в инкубатор может привести к колебаниям температуры, которые отрицательно влияют на рост клеток.
3. Подтверждение экспрессии рекомбинантных белков
- С помощью стерильной петли подбирают часть оставшихся клеток из той же колонии трансформированных клеток E. coli dnaK756.
- Инокуляцию клеток в 10 мл YT-бульона с добавлением 50 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина и 100 мкг/мл ампициллина. Инкубировать в течение ночи (17 ч) при 37 °C при встряхивании со скоростью 150 об/мин.
- Перенесите культуру в 90 мл стерильного бульона 2x YT, содержащего необходимые антибиотики, как указано в шаге 3.2. Дайте клеткам вырасти до середины логарифмической фазы (OD600 = 0,4-0,6).
- Возьмите 2 мл образца культуры перед индукцией (0 ч индукционной пробы).
- Добавьте IPTG до конечной концентрации 1 мМ, чтобы индуцировать выработку белка и повторно инкубировать клетки при 37 °C.
- Возьмите вторую пробу объемом 2 мл через 6 ч после индукции.
- Собирают клетки центрифугированием при 5000 x g в течение 10 мин. Поддерживайте температуру центрифуги на уровне 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость.
- Повторно суспендировать гранулы в буфере PBS (137 мМ NaCl, 27 мМ KCl, 4,3 мМNa2HPO4, 1,4 мМ KH2PO4) и хранить при -20 °C.
4. SDS-PAGE и вестерн-блоттинг
- Приготовьте 2x 10% геля SDS, как описано выше19.
- Сохраните один из гелей SDS-PAGE для последующего окрашивания с помощью красителя Coomassie для просмотра белковых полос. Используйте второй гель SDS-PAGE для проведения вестерн-блоттинг-анализа.
- Аликвотируют 80 мкл ресуспендированных образцов и смешивают с 20 мкл 4-кратного загрузочного буфера Laemmli SDS.
- Кипятить суспензию при 100 °С в течение 10 мин. Затем загрузите 10 мкл каждого образца в сборный гель SDS (см. таблицу материалов).
- Проводят электрофорез при комнатной температуре в течение 1 ч с использованием напряжения 120 В в 1х растворе СДС прогонного буфера (25 мм Трис, 250 мм глицина, 0,1% (по массе) СДС).
- Окрашивают гель красителем Кумасси (см. таблицу материалов) в течение 1 ч с последующим обесцвечиванием с использованием обесцвечивающего буфера (50% (v/v) метанола, 10% (v/v) уксусной кислоты в дистиллированной воде) в течение 2 ч.
- Визуализируйте белковые полосы, присутствующие в геле, с помощью системы визуализации геля (см. таблицу материалов). Повторно запустите другой гель SDS-PAGE с теми же образцами, следуя вышеупомянутому протоколу.
- Когда электрофоретический прогон заканчивается, возьмите гели SDS-PAGE для проведения вестерн-блоттинг-анализа, как описано ранее19.
- Промыть нитроцеллюлозную мембрану, на которую белки переносились три раза, в промывочном буфере (TBS-Tween, pH 7,4 [50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1% (v/v) Tween]).
- Используйте α-DnaK (см. таблицу материалов) для обнаружения DnaK и α-PfHsp70-17 для обнаружения KPf и его мутанта KPf-V436F), соответственно.
- Используйте антитела в разведении 1:2000 в 5% обезжиренном молоке. Инкубируют при 4 °C при встряхивании при 60 оборотах/мин в течение 1 ч.
- Удаляют неспецифически связанные антитела, промывая нитроцеллюлозную мембрану в TBS-Tween 3 раза в течение 15 мин.
- Инкубируют мембрану во вторичном антителе (α-кролик, см. таблицу материалов) в тех же условиях, что и на предыдущем этапе. Затем следует последующая промывка в тех же условиях, что и первичное антитело.
- Устраните полосы с помощью реагента для обнаружения улучшенной хемилюминесценции (ECL).
- Визуализируйте полосы с помощью гелевого имидж-сканера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2 представлено изображение отсканированного агара, содержащего клетки, которые были обнаружены и культивированы при допустимой температуре роста 37 °C и 43,5 °C соответственно. В правой части рисунка 2 вырезанные компоненты вестерн-блоттинга представляют экспрессию DnaK, KPf и KPf-V436F в клетках E. coli dnaK756. Как и ожидалось, все клетки E. coli dnaK756, культивируемые при допустимой температуре роста 37 °C, успели вырасти. Однако в условиях непермиссивного роста при 43,5 °С удалось вырасти только клеткам, гетерологически экспрессирующим DnaK и KPf, о чем сообщалось ранее 6,9,20 (рис. 2). С другой стороны, клетки, экспрессирующие KPf-V436F, росли только при 37 °C, но не могли расти при 43,5 °C. Это свидетельствует о том, что DnaK и KPf способны восстанавливать дефект роста клеток E. coli dnaK756 в условиях теплового стресса. Неспособность клеток, гетерологически экспрессирующих KPf-V436F, поддерживать рост клеток при 43,5 °C, демонстрирует отсутствие шаперонной функции этого белка. В этом отношении KPf-V436F служит идеальным белком отрицательного контроля.
Рисунок 1: Принцип проведения анализа комплементации с использованием клеток E. coli dnaK756 для изучения шаперонной функции гетерологически экспрессируемых белков. E. coli dnaK756 экспрессирует нативный белок DnaK756, который не способен защитить клетки от теплового стресса. Введение функционального гетерологичного Hsp70 спасает клетки от гибели при воздействии теплового стресса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ комплементационных пластин, демонстрирующий возможности DnaK и KPf для защиты клеток E. coli dnaK756 от теплового стресса. Трансформированные клетки культивировали при 37 °C (разрешающая температура роста) и 43,5 °C (непермиссивная температура роста). Клетки были стандартизированы и покрыты в виде серийных разведений. Буква «N» символизирует «аккуратный», представляя собой первое пятно, состоящее из неразбавленных клеток. В крайнем правом углублении находятся западные блоттинги, представляющие экспрессию трех белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол демонстрирует полезность клеток E. coli dnaK756в исследовании шаперонной функции гетерологически экспрессируемого Hsp70. Этот анализ может быть использован для скрининга ингибиторов, нацеленных на функцию Hsp70 в целлюло. Однако одним из ограничений этого метода является то, что Hsp70, неспособные заменить DnaK в E. coli, несовместимы с этим анализом. Отсутствие посттрансляционной модификации21 некоторых ненативных Hsp70 может объяснить отсутствие у них функции в системе E. coli . Анализ комплементации на основе дрожжей22 может устранить некоторые недостатки анализа на основе E. coli.
Несколько ключевых шагов имеют решающее значение для обеспечения воспроизводимых результатов. Они включают в себя обеспечение того, чтобы во время нанесения покрытия использовались только клетки, преобразованные соответствующей плазмидной конструкцией. Кроме того, важно избегать загрязнения культуры на протяжении всех этапов. Кроме того, поскольку подверженные стрессу клетки E . coli DnaK восприимчивы к чрезмерной филаментации10, важно избегать сильного встряхивания во время культивирования, так как это физическое напряжение способствует обширной филаментации. Чрезмерно филаментированные клетки дают более высокие ложные показания кажущегося роста при OD600, что приводит к завышенной оценке роста культуры и отрицательно влияет на стандартизацию клеток перед нанесением покрытия. Хотя Hsp70 не является необходимым для роста кишечной палочки в нормальных условиях, клетки, лишенные этого белка,восприимчивы к стрессу. По этой причине клетки E. coli dnaK756 растут гораздо медленнее после трансформации или во время их восстановления из запасов глицерина. Кроме того, они чрезвычайно чувствительны к колебаниям температуры. Поэтому важно не открывать дверцу инкубатора после того, как пластины с агаром с покрытием помещены внутрь, до тех пор, пока не придет время рассмотреть пластины.
Данные вестерн-блоттинга важны для подтверждения экспрессии соответствующих рекомбинантных белков Hsp70 в клетках E. coli dnaK756. Неспособность экспрессировать соответствующий белок приводит к ложноотрицательному результату для клеток, растущих при непермиссивной температуре роста.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или иных конфликтов интересов.
Acknowledgments
Работа была поддержана грантовым финансированием, полученным от Международного центра генной инженерии и биотехнологии (ICGEB) номер гранта, HDI/CRP/012, Исследовательского директората Университета Венды, грант I595, Департамента науки и инноваций (DSI) и Национального исследовательского фонда (NRF) Южной Африки (номера грантов, 75464 и 92598), присужденных AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
- Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
- Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Edkins, A. L., Boshoff, A. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. , Springer. (2021).
- Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
- Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
- Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
- Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
- Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).
- Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
- Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).
- Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
- Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
- Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
- Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
- Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
- Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
- Sato, S., Wilson, R. I.
- Shonhai, A. Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University. , Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007).
- Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).
- Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
- Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).
