Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen
Summary
In diesem Video-Artikel präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von einzelnen oder mehreren<em> Drosophila</em> Da Neuronen aus dritten Larvenstadium mit der Infrarot-Aufnahme (IR)-Klasse von Laser Capture Mikrodissektion (LCM). RNA aus den isolierten Neuronen erhalten können leicht für nachgelagerte Anwendungen wie qRT-PCR oder Microarray-Analysen verwendet werden.
Abstract
Die dendritischen Verzweigung (da) Neuronen des Drosophila peripheren Nervensystem (PNS) liefern ein hervorragendes Modell, in dem die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen klassenspezifischen Dendriten Morphogenese 1,2 untersuchen. Zur Erleichterung der molekularen Analyse von klassenspezifischen da Neuron Entwicklung ist es wichtig, diese Zellen in eine reine Population zu erhalten. Obwohl eine Reihe von verschiedenen Zell-und Gewebe-spezifische RNA-Isolierung Techniken existieren für Drosophila-Zellen, einschließlich Magnetic-Bead-basierten Zellreinigung 3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) 5-8, und RNA bindenden Proteins Strategien 9, keine Diese Methoden können leicht zur Isolierung von einzelnen oder mehreren Klassen-spezifischen Drosophila da Neuronen mit einem hohen Grad an räumlicher Präzision eingesetzt werden. Laser Capture Mikrodissektion (LCM) wurde als ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug, das benutzt, um bestimmte Zelltypen aus Gewebeschnitten isoliert mit einem hohen Grad an räumlicher Auflösung und Genauigkeit kann entstanden. RNA aus isolierten Zellen erhalten kann dann für Analysen einschließlich qRT-PCR und Microarray-Expression Profiling innerhalb einer bestimmten Zelltyp 10-16 verwendet werden. Bis heute hat LCM nicht umfassend in die Analyse von Drosophila Gewebe und Zellen 17,18, einschließlich da Neuronen an der dritten Larvenstadium Larvenstadium der Entwicklung eingesetzt.
Hier präsentieren wir unsere optimiertes Protokoll für die Isolierung von Drosophila da Neuronen mit der Infrarot-(IR)-Klasse von LCM. Diese Methode ermöglicht die Erfassung von Einzel-, Klassen-spezifischen oder mehrere da Neuronen mit hoher Spezifität und räumlicher Auflösung. Alter abgestimmten dritten Larvenstadium Ausdruck eines UAS-mCD8:: GFP 19 Transgen unter der Kontrolle von entweder der Klasse IV da Neuron spezifischen ppk-GAL4 20 Treiber oder in den gesamteuropäischen da Neuron spezifischen 21-7-GAL4 21 Treiber wurden für diese verwendet Experimente. RNA aus den isolierten da Neuronen erhalten ist von sehr hoher Qualität und kann direkt für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich qRT-PCR oder Microarray-Analysen verwendet werden. Darüber hinaus kann diese LCM-Protokoll leicht angepasst werden, zu erfassen anderen Drosophila Zelltypen eine verschiedene Stadien der Entwicklung abhängig vom Zelltyp spezifisch, GAL4-driven Expressionsmuster von GFP.
Protocol
Discussion
Das Protokoll hier vorgestellte beschreibt unsere optimierte Methode zur Isolierung von Drosophila peripheren Neuronen über LCM. Während dieser LCM-Protokoll für die spezifische Isolierung von Einzel-, Klassen-spezifischen oder mehrere Drosophila da Neuronen ab dem dritten Larvenstadium Larvenstadium der Entwicklung konzipiert wurde, konnte geringfügige Änderungen des Protokolls ohne weiteres für den Fang von anderen Drosophila Zelltypen aus allen Entwicklungs angepasst werden Phasen mit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Drs. Yuh-Nung Jan und Wes Grueber für die Bereitstellung von fly Aktien in dieser Studie verwendet wird, und Virginia Espina, Dr. Emanuel Petricoin und Dr. Lance Liotta für die Unterstützung bei LCM. Die Autoren danken Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memorial Trust für die Unterstützung dieser Forschung (DNC) und der George Mason University Provost s Office (EPRI).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | ||
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | ||
| RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | ||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions | |
| Thin walled reaction tube with domed cap | GeneAmp, Applied Biosystems | N8010611 | ||
| ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | ||
| Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | ||
| Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | ||
| CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | ||
| 75×100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | ||
| Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | ||
| Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | ||
| 70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | ||||
| Dry ice |
Equipment:
- Cryostat
- 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
- -80°C freezer
- Incubator
- PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)
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