Summary

のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションショウジョウバエ末梢ニューロン

Published: May 24, 2010
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Summary

このビデオ、記事では、単一または複数単離するための方法を提示<em>ショウジョウバエ</em赤外線キャプチャ(IR)レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)のクラスを使用して、三齢幼虫から> DAニューロン。分離された神経細胞から得られたRNAは、容易に定量RT – PCRやマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションに使用することができます。

Abstract

ショウジョウバエ末梢神経系(PNS)の樹状分枝(DA)ニューロンはクラス特有の樹状突起の形態形成の1,2の分子メカニズムを調査するための優れたモデルシステムを提供しています。クラス固有のDAニューロンの発達の分子解析を容易にするために、それは純粋な集団で、これらの細胞を得ることが不可欠です。異なる細胞、および組織特異的なRNAの分離技術の範囲は、磁気ビーズをベースセル精製3,4、蛍光活性化細胞選別(FACS)5-8、およびRNA結合タンパク質に基づいて戦略を9日のなしを含むショウジョウバエの細胞にもありますが、これらのメソッドは、容易に空間的な精度の高い単一または複数のクラス固有のショウジョウバエ DAニューロンを単離するために利用することができます。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)は、空間分解能と高精度に組織切片から特定の細胞型を分離するために使用できる非常に強力なツールとして登場しました。単離された細胞から得られたRNAは、その後、定量RT – PCRおよび特定の細胞型10月16日内マイクロアレイの発現プロファイリングを含む、解析に使用することができます。日付に、LCMは広く開発の三齢幼虫期におけるDAニューロンを含むショウジョウバエの組織や細胞17,18、の分析に適用されていない。

ここでは、LCMの赤外線(IR)クラスを使用してショウジョウバエの DAニューロンの単離のために私達の最適化されたプロトコルを提示する。このメソッドは、高い特異性と空間分解能を持つ単一の、クラス固有のまたは複数のDAニューロンのキャプチャが可能になります。年齢をマッチさせたUAS – mCD8を表現する三齢幼虫::クラスIV DAニューロンの特定のPPK – GAL4 20ドライバーまたはパン- DAニューロン固有のどちらの制御下にGFP 19遺伝子21 – 7 – GAL4 21ドライバは、これらのために使用された実験。孤立したDAニューロンから得られたRNAは非常に高品質のものであり、直接定量RT – PCRやマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションに使用できます。さらに、このLCMプロトコルが容易にGFPの細胞型特異的、GAL4 –ドリブン発現パターンに応じて、さまざまな開発段階に依存する他のショウジョウバエの細胞タイプをキャプチャするために適応させることができます。

Protocol

ショウジョウバエ末梢神経細胞のLCMに関する一般のコメントアップ組織のタイプと必要なセル数に応じて、LCMのための週以上に、6時間から許可する。 すべての手順は、標準的な手順は、次の厳密にRNaseフリーの条件下で実施されています。 21から7 – GAL4のいずれかを発現する幼虫、UAS – mCD8::GFPまたはPPK – GAL4、UAS – mCD8::GFP</…

Discussion

本明細書において提示されるプロトコルは、LCMを経由してショウジョウバエ末梢神経細胞の単離のための私達の最適化方法を説明します。このLCMプロトコルが開発の三齢幼虫の段階から、単一の、クラス固有のまたは複数のショウジョウバエ DAニューロンの特定の単離のために設計されたものですが、プロトコルのマイナーな修正は、容易に全ての発生から他のショウジョウ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、博士に感謝する。 LCMの支援のために本研究で使用したフライ株式、およびバージニアEspina、博士エマニュエルPetricoinと博士ランスリオッタを提供するための塩原-ティンニン月とウェスGrueber。著者らはこの研究の支援(DNC)とジョージメイソン大学の学長のオフィス(EPRI)のためにトーマスF.とケイトミラーJeffressメモリアルトラストを認める。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)   MP Bioproducts PBS10X02 Diluted to 1X working solution
2.5% Trypsin   Sigma-Aldrich T1426  
RNase-AWAY   Sigma-Aldrich 83931  
Xylenes, histological grade   Fisher Scientific X3S-4  
RNAse-free water   Fisher Scientific BP561-1  
Optimal Cutting Temperature (OCT) compound   Tissue-Tek 4583  
PicoPure RNA Isolation Kit   Molecular Devices KIT0204 Follow manufacturer’s instructions
Thin walled reaction tube with domed cap   GeneAmp, Applied Biosystems N8010611  
ExtracSure Sample Extraction Device   Molecular Devices LCM 0208  
Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps   Molecular Devices LCM0505  
Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices   Molecular Devices LCM0504  
CapSure HS LCM caps   Molecular Devices LCM0213  
75×100 mm glass slides   Fisher Scientific 12-544-3  
Tissue embedding molds   Fisher Scientific NC9642669  
Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes   USA Scientific 1415-5390  
70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol        
Dry ice        

Equipment:

  • Cryostat
  • 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
  • -80°C freezer
  • Incubator
  • PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)

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Cite This Article
Iyer, E. P. R., Cox, D. N. Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons. J. Vis. Exp. (39), e2016, doi:10.3791/2016 (2010).

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