Láser microdisección de captura de Drosophila Neuronas periféricas
Summary
En este video-artículo se presenta un método para aislar uno o varios<em> Drosophila</em> Neuronas da a partir de larvas de tercer estadio con la captura de infrarrojos (IR) de la clase Laser Microdisección Captura (LCM). ARN obtenido de las neuronas aisladas puede ser fácilmente utilizada para aplicaciones posteriores como QRT-PCR o microarrays de análisis.
Abstract
La arborización dendrítica (da), las neuronas del sistema de Drosophila nervioso periférico (SNP) proporcionan un excelente sistema modelo en el que investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la clase específica de 1,2 morfogénesis dendrita. Para facilitar el análisis molecular de la clase específica de desarrollo da las neuronas, es vital para obtener estas células en una población pura. Aunque una variedad de células, tejidos y técnicas específicas de aislamiento de ARN de las células de Drosophila existen, incluyendo la purificación magnética cordón celular basado en 3,4, fluorescente clasificación de células activadas (FACS) 5-8, y la proteína de unión a ARN estrategias basadas en 9, ninguno de estos métodos se pueden utilizar fácilmente para el aislamiento de una o varias clases específicas de Drosophila neuronas da con un alto grado de precisión espacial. Láser captura microdissection (LCM) se ha convertido en una herramienta extremadamente poderosa que puede ser usado para aislar determinados tipos de células a partir de secciones de tejido con un alto grado de resolución espacial y precisión. ARN obtenido a partir de células aisladas puede ser utilizado para los análisis incluidos QRT-PCR y microarrays de perfiles de expresión en un tipo de célula 10-16. Hasta la fecha, LCM no ha sido ampliamente aplicado en el análisis de los tejidos y las células de Drosophila 17,18, incluyendo las neuronas da en la etapa larval tercer estadio de desarrollo.
Aquí les presentamos nuestro protocolo optimizado para el aislamiento de las neuronas de Drosophila da con los rayos infrarrojos (IR) clase de LCM. Este método permite la captura de las neuronas individuales, da clases específicas o múltiples, con una alta especificidad y resolución espacial. La misma edad larvas tercer estadio que expresa una UAS-mCD8:: GFP 19 transgén bajo el control de cualquiera de la clase IV da neurona específica PPK-GAL4 20 driver o el pan-da neurona específica 21-7 21-GAL4 conductor fueron utilizados para estos experimentos. ARN obtenido a partir del aislado neuronas da es de muy alta calidad y se pueden usar directamente para las aplicaciones posteriores, incluida la QRT-PCR o microarrays de análisis. Además, este protocolo de LCM se pueden adaptar fácilmente para capturar otros tipos de células Drosophila una las distintas etapas de desarrollo depende del tipo específico de célula, GAL4 impulsada por el patrón de expresión de GFP.
Protocol
Discussion
El protocolo presentado en este documento se describe nuestro método optimizado para el aislamiento de las neuronas de Drosophila periféricos a través de LCM. Aunque este protocolo de LCM fue diseñado para el aislamiento específico de neuronas individuales, específicos de la clase o múltiples Drosophila da a partir de la tercera fase estadio larval de desarrollo, modificaciones menores del protocolo podría ser fácilmente adaptado para la captura de otros tipos de células de todo el desarrollo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los Dres. Yuh-Nung Jan y Grueber Wes para proporcionar poblaciones de moscas utilizadas en este estudio, y Virginia Espina, el Dr. Emanuel Petricoin y el Dr. Lance Liotta para obtener ayuda con LCM. Los autores agradecen la F. Thomas y Kate Miller Jeffress Memorial Trust para el apoyo de esta investigación (DNC) y la Universidad George Mason Provost Oficina s (EPRI).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | ||
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | ||
| RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | ||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions | |
| Thin walled reaction tube with domed cap | GeneAmp, Applied Biosystems | N8010611 | ||
| ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | ||
| Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | ||
| Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | ||
| CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | ||
| 75×100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | ||
| Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | ||
| Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | ||
| 70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | ||||
| Dry ice |
Equipment:
- Cryostat
- 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
- -80°C freezer
- Incubator
- PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)
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