Fitc-Dextran Alimentación: Un método para cuantificar la permeabilidad intestinal en C. elegans

Overview

Este video introduce un método para visualizar y medir la integridad del lúmenes intestinales C. elegans alimentando gusanos con etiqueta FITC dextrano.  El protocolo de ejemplo muestra el ensayo realizado con gusanos tratados con 3,3'-diindolylmethane (DIM) y alimentados con patógenos.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Le et al, Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans, J. Vis. (2019).

1. Preparación de placas NGM para probar los efectos de un químico (DIM) en la permeabilidad intestinal de C. elegans alimentado con P. aeruginosa
   1. Añadir 0,5 g de peptona, 0,6 g de NaCl, 195 ml de agua destilada, un agitador magnético y 6,8 g de agar a una botella de vidrio de 500 ml (agar NGM).
   2. Añadir 0,5 g de peptona, 0,6 g de NaCl, 195 ml de agua destilada y un agitador magnético sin agar a otra botella de vidrio de 500 ml (caldo NGM).
   3. Autoclave las dos botellas (de los pasos 1.1–1.2), una botella de vidrio vacía de 100 ml y una botella de vidrio vacía de 500 ml durante 15 minutos a 121 °C. A continuación, deje que el medio que contiene botellas se enfríe a 55 °C en el baño de agua durante 30 minutos. Mantenga el medio del agar en el baño de agua y retire la botella que contiene caldo (del paso 1.2) para el siguiente paso.
   4. Añadir los productos químicos aditivos al caldo NGM: 0,4 ml de 1 M CaCl_2,0,4 ml de colesterol en etanol (ml), 0,4 ml de 1 M MgSO₄ y 10 ml de 1 M KPO₄ (todos estos componentes deben esterilizarse aparte del colesterol en etanol). A continuación, revuelva la mezcla bien con un agitador magnético a 55 °C.
   5. Etiquete la botella de vidrio vacía autoclavada de 500 ml con sulfóxido de dimetil (DMSO) y la botella de vidrio vacía autoclavada de 100 ml con DIM.
   6. Transfiera 50 ml de caldo NGM a la botella de 100 ml etiquetada con DIM. Añadir 500 μL de 20 mM de caldo DIM en la botella y mezclar bien.
      NOTA: DIM se disuelve en DMSO (stock DIM de 20 mM).
   7. Retire rápidamente el medio de agar NGM del baño de agua, agregue 50 ml del medio de agar NGM en la botella con etiqueta DIM y mezcle bien.
   8. Coloque una alícuota de 20 ml de medio NGM que contenga DIM en cada plato Petri de 90 mm x 15 mm. Aproximadamente cinco placas NGM que contienen DIM se pueden hacer a partir de este paso.
      NOTA: La concentración final de DIM en cada placa NGM será de 100 μM.
   9. Para preparar la placa NGM que contiene DMSO, transfiera 150 ml de caldo NGM en el frasco de 500 ml etiquetado por DMSO. Agregue 1,5 ml de DMSO a la botella y mezcle bien.
   10. Agregue 150 ml del medio de agar NGM a la botella etiquetada por DMSO y mezcle bien.
   11. Coloque una alícuota de 20 ml de medio NGM que contenga DMSO en cada plato Petri de 90 mm x 15 mm. Aproximadamente quince placas NGM que contienen DMSO se pueden hacer a partir de este paso.
       NOTA: La concentración final de DMSO en cada placa NGM será del 0,5%.
   12. Solidifique las placas a temperatura ambiente durante al menos 3 h y guárdelas a 4 °C hasta su uso.
       NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
   13. Retire el cultivo E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 del refrigerador y vórtice de 4 °C del cultivo correctamente antes de extenderse a las placas NGM.
   14. Coloque 800 μL del cultivo bacteriano E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 en cada placa de agar NGM fresca y permita que las placas se sequen en una incubadora de 20 °C durante la noche.
       NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Para el tercer experimento(Figura 1),se prepararon dos placas NGM que contienen DMSO recubiertas con E. coli OP50 en vivo, una placa NGM que contiene DMSO recubierta con P. aeruginosa PAO1 en vivo, y una placa NGM que contiene DIM recubierta con P. aeruginosa PAO1 en vivo.
2. Tratamiento de bacterias o DIM y fitc-dextran alimentación
   1. Incubar los huevos sincronizados por edad a 20 °C durante 64 h en placas NGM complementados con E. coli OP50 en vivo como alimento.
   2. Lave la larva L4 sincronizada por la edad con amortiguador S y transfiéralas (más de 500 gusanos) a las placas NGM de tratamiento que contienen diferentes bacterias y productos químicos. Incubarlos a 20 °C durante 48 h.
      NOTA: El tiempo de tratamiento puede variar de 24 a 72 h, según las bacterias y productos químicos utilizados. El efecto terapéutico o preventivo de DIM también puede evaluarse pretratando los gusanos con patógenos y luego tratando los gusanos con DIM (el efecto terapéutico) o pretratando los gusanos con DIM y luego tratando con patógenos (el efecto preventivo).
   3. Para preparar las placas suplementadas con FITC-dextran, mezcle 2 ml de E. coli OP50 inactivada térmicamente con 4 mg de FITC-dextran. A continuación, divida 100 μL de la mezcla FITC-dextran y E. coli OP50 en veinte placas de agar NGM frescas (60 mm x 15 mm) y deje que las placas se sequen durante 1 h en un banco limpio.
      NOTA: La concentración final de FITC-dextran en cada placa NGM será de 20 μg/ml.
   4. Prepare cinco placas NGM que contengan E. coli OP50 sin FITC-dextran para el tratamiento de control del vehículo. Para ello, divida 100 μL de E. coli OP50 inactivadas térmicamente a cada placa de agar NGM fresca (60 mm x 15 mm) y deje que las placas se sequen durante 1 h en un banco limpio.
      NOTA: Para cada experimento independiente, se requieren quince placas NGM complementadas con FITC-dextran y cinco placas NGM sin FITC-dextran.
   5. Después de 48 h de tratamiento (desde el paso 2.2), lave los gusanos con amortiguador S, transfiera los gusanos a las placas suplementadas con FITC-dextran y las placas NGM sin FITC-dextran e incuba las placas durante la noche (14-15 h).
      NOTA: Para cada grupo de tratamiento, se requieren 5 réplicas de tinción fitc-dextrano (o alimentación de control de vehículos).
   6. Lave los gusanos con amortiguador S y déjenlos arrastrarse en la placa de agar NGM fresca durante 1 h.
      NOTA: Para cada experimento independiente, se necesitan un total de 20 placas NGM frescas. En este paso, puede utilizar la placa NGM complementada sin O con E. coli OP50.
   7. Añadir 50 μL de solución de formaldehído al 4% a cada pozo de una placa plana negra de 96 pozos. Transfiera aproximadamente 50 gusanos de cada placa NGM a cada pozo para mediciones de fluorescencia. Después de 1 a 2 min, retire a fondo todo el formaldehído de cada pozo y agregue 100 μL de medio de montaje para recubrir los pozos.
      NOTA: Solución de formaldehído (4%) se utiliza para inmovilizar y arreglar los gusanos. Para cada grupo de tratamiento, se utilizan 5 pozos (5 réplicas) para el análisis de imágenes.
3. Imágenes C. elegans con el sistema de imágenes opereta y determinación de permeabilidad intestinal mediante la medición de la absorción de fluorescencia FITC-dextran
   NOTA: La estereomicroscopia fluorescente se puede utilizar para el análisis de imágenes en lugar del sistema Operetta.
   1. Capture imágenes de fluorescencia y mida la intensidad de fluorescencia utilizando el sistema de imágenes de alto contenido Operetta y analice las imágenes con el software Harmony.
   2. En el software Harmony, pulse el icono Abrir tapa para abrir la tapa y colocar la placa en la máquina.
   3. Configure los parámetros.
   4. Haga clic en Configurar, seleccione el tipo de placa (fondo plano de corning de 96 pozos) y agregue los canales (canales de campo brillante y EGFP).
   5. Ajuste el diseño. Vaya a la selección Diseñoy, a continuación, seleccione Rastrear y ajuste los parámetros (primera imagen a 1 μm, el número de planos es 10, la distancia es de 1 μm).
   6. Seleccione uno de los pozos de tratamiento y un campo de captura y pulse Prueba para comprobar si las imágenes son satisfactorias en la sección Ejecutar experimento.
   7. Si las imágenes son satisfactorias, vuelva a la sección Configurar y pulse el icono Restablecer al final de la pantalla. A continuación, seleccione todos los pozos de destino y un número adecuado de campos de captura.
   8. Vaya a Ejecutar experimento de nuevo e introduzca el nombre de la placa y, a continuación, pulse Inicio para comenzar a procesar.
   9. Para medir la intensidad de la fluorescencia, vaya a la sección de análisis de imagen e introduzca la imagen. Encuentre la celda eligiendo el canal EGFP y el método B. Ajuste el umbral común a 0,5, el área a >200 μm^2,el factor dividido a 3,0, el umbral individual a 0,18 y el contraste a más de 0,18. A continuación, calcule las propiedades de intensidad y elija la media como salida. Pulse el icono Aplicar para guardar la configuración.
   10. Vaya a la sección Evaluación para medir la intensidad obteniendo un mapa de calor y una tabla de datos. Establezca el parámetro Readout en Cells — Intensity Cell EGFP Mean — Mean per Well e inicie la evaluación.
       NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
   11. Para extraer los datos de Operetta, haga clic en el botón Configuración y elija Administración de datos.
   12. Elija Write archivey, a continuación, abra el examinar y seleccione el archivo.
   13. Para seleccionar el archivo, haga clic en la pequeña señal + en la esquina izquierda y, a continuación, haga clic en Medición y elija Nombre de placa.
   14. Seleccione el archivo y haga clic en Aceptar.
   15. Seleccione la ruta de acceso para guardar el archivo haciendo clic en Examinar señal en la ruta activa.
   16. Haga clic en Iniciar para guardar el archivo de datos.
       NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
4. Análisis estadístico de la fluorescencia FITC-dextran de C. elegans
   1. Importe los datos y calcule la desviación media y estándar (SD) utilizando un software de estadísticas.
   2. Analice la diferencia significativa con el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Representative Results

Figura 1: El efecto de DIM en la permeabilidad intestinal de C. elegans alimentado P. aeruginosa. Imágenes microscópicas de gusanos de (A) E. coli OP50 sin alimentación FITC-dextran, (B) E. coli con alimentación FITC-dextrano, (C) P. aeruginosa PAO1 con alimentación FITC-dextran, y (D) P. aeruginosa y DIM (100 μM) cotratamiento con alimentación FITC-dextran. Barra de escala = 1 mm (blanco) y 200 μm (negro). Las larvas L4 sincronizadas por edades fueron incubadas durante 48 h en placas NGM sembradas con E. coli viva(A, B), P. aeruginosa viva(C), P. aeruginosa viva y DIM (D). A continuación, los gusanos fueron transferidos a placas que contenían FITC-dextran (B-D), a excepción del control del vehículo (A). (E) La intensidad de fluorescencia FITC indica que la permeabilidad intestinal de C. elegans se vio afectada por DIM. Columnas y barras de error indican la media ± SD. ***P < 0.001 para una diferencia significativa con respecto al control del vehículo. ^###P < 0.001 y ^##P < 0.01 para una diferencia significativa con los gusanos tratados con FITC-dextran alimentados con P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Este gráfico es representativo de dos experimentos independientes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-diindolylmethane	Sigma	D9568
90×15 mm Petri dishes	SPL Life Sciences, South Korea	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Formaldehyde solution	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Wild type
Cholesterol	Sigma	C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene	Corning Incorporated	REF. 3631
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran	Sigma	FD10S
Harmony software	PerkinElmer		verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma	F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Korean Collection for Type Culture	KCTC NO. 1637
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Stereo Microscope	Nikon, Japan	SMZ800N