UV 조사: 엑스트라크로모솜 배열을 통합하는 방법

Overview

전분의 미세 분사는 일반적으로 C. elegans 균주에 큰 엽산모말 배열을 가진 긴장을 초래하며, 이는 변형 유전자의 가변 발현 및 전송을 초래합니다.  UV 조사는 어레이의 염색체 통합과 보다 안정적인 트랜스진 전달을 유도할 수 있다.

Protocol

이 프로토콜은 Mariol 외에서 발췌,  C. elegans 게놈으로 높은 전송 속도와 엑스트라 크로모솜 배열을 통합하기위한 빠른 프로토콜, J. Vis. Exp. (2013).

1. UV 조사 및 형질 전환 벌레의 복구

1. 웜 조사:
   1. 30-100형형형L4 동물을 별도의 배양판(접시별로 15-20마리)에 놓습니다.
   2. 뚜껑을 제거한 플레이트를 UV 크로스 링커에 놓습니다. 0.012 J/cm^2에서웜을 조사한다. 균주는 UV에 다소 민감하며 사용되는 UV 조사관에 따라 결과가 가변적일 수 있습니다. 0.010-0.015 J/cm² 사이의 투여 량 범위는 테스트할 수 있다.
2. 조사 후 웜 복구:
   1. 복구를 위해 조사된 웜이 있는 플레이트를 15°C에서 하룻밤 동안 배치합니다.
   2. 살아있는 동물 수를 확인합니다. 우리의 손에, 약 80-90 %의 생존율은 효율적인 조사에 적응된다.
   3. 자손이 발달 단계에 도달할 때까지 조사된 동물을 15-25°C에서 성장시켜 관절 마커 발현의 관찰을 허용한다.

2. 통합 형질전환선의 격리

1. F1 동물의 선택 :
   1. 단일 150-200 형광 F1 동물은 별도의 배양 판에. 고도로 전송되는 선(≥80%)의 경우 100마리의 F1 동물로 충분합니다.
   2. 자손이 형광 F2 동물의 관찰을위한 적절한 단계에 도달 할 때까지 이러한 F1 플레이트를 15-25 ° C에서 유지합니다.
   3. F1 동물이 멸균되었거나 죽었다는 것을 나타내는 모든 F1 플레이트를 폐기하거나, f1 동물이 예상 속도로 트랜스진을 전송하지 않았음을 나타내는 형광 F2 동물이 거의 없거나 거의 없음을 나타냅니다. 이 단계는 빠르며 ≥75% 형광 자손(표1)을나타내는 F1 플레이트를 선택하기 위해 형광 F2 웜의 백분율을 추정해야 하는 표준 프로토콜과 비교할 때 실질적인 이점을 나타낸다.
2. F2 동물 선택:
   1. 각 선택된 F1 플레이트에서 4마리의 형광 형질 전환 F2 동물. 형광 성 전진(예: mCherry, gfp 또는 dsRed)을 사용할 때, 이러한 동물이 통합 어레이에 대해 동종구임을 나타낼 수 있기 때문에 높은 수준의 형광을 가진 F2 웜을 선택하십시오. F2 동물을 따기 시 다음 단계에서 거짓 네거티브를 피하기 위해 계란이나 애벌레를 따라 다니지 않는 것이 중요합니다.
   2. 15-25 °C에서 F2 동물을 성장시다.
3. 통합 형질전환균의 격리 및 검증:
   1. 100% 형광 형 형질형 F3 웜용 화면 F2 플레이트. 단일 불형 웜의 존재가 플레이트를 버려야 한다는 것을 나타내기 때문에 화면은 매우 빠름입니다. 통합 된 트랜스진을위한 F2 동물 균질은 100 % 동질 형광 자성을 제공합니다.
   2. 선택된 플레이트에서 8마리의 형광 F3 동물 중 하나만이 트랜스진의 100% 상속을 확인한다. 이론적으로, 한 동물을 따기는이 단계에서 충분하다. 그러나, 8개의 형광 F3 동물을 따기는 조사가 웜 생리학에 중요한 유전자에 영향을 미치는 돌연변이를 무작위로 유도할 수 있기 때문에 불모성 또는 건강에 해로운 동물을 선택하지 않기 위하여 필요할 수 있습니다.
   3. 가능하면 여러 개의 독립적인 통합 형균, 즉 다른 F1 동물에서 회복된 균주를 유지합니다.

Representative Results

표 1.  C. elegans 게놈에 초염색체 배열 통합을 위한 표준 및 향상된 프로토콜의 비교. 거의 동일한 주파수에서 전송되는 2개의 비통합된 전진은 표준 또는 개선된 프로토콜을 사용하여 통합되었다. 주요 차이점은 표준 프로토콜에서 모든 F1 플레이트에 자손의 화면이 트랜스 제닉 F2 웜의 비율을 추정하기 위해 수행된다는 사실에 있다, 이는 ≥ 75 %가되어야한다. 이 단계는 특히 초기 전송 속도가 75 %에 가까운 경우 시간이 오래 걸립니다. 개선된 프로토콜에서, 트랜스제닉 F2 동물을 운반하는 각 F1 플레이트에서 4개의 F2 웜을 단독으로 수행하고 자손(F3)에서 형질전환 웜의 100%를 빠르게 검사하는 것으로 충분하다. 표준 프로토콜이 적용됩니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms