Productie van Chick Embryo Extract voor de teelt van Muizen neurale lijst Stem Cells
Summary
Om neurale lijst stamcellen (NCSC) kweken in vitro, is een speciaal medium (NCSCM) vereist. Essentieel onderdeel van NCSCM is kippenembryo extract (CEE). We beschrijven hier accurate technieken om een maximale hoeveelheid van pure en hoge kwaliteit CEE, inclusief details zoals de isolatie, maceratie, centrifugeren en filtratie processen te produceren.
Abstract
De neurale lijst komt voort uit het neuro-ectoderm tijdens de embryogenese en blijft slechts tijdelijk. Vroege experimenten al ondoorlaatbaar pluripotente voorlopercellen naar een integraal onderdeel van de neurale lijst 1. Fenotypisch, zijn neurale stamcellen (NCSC) gedefinieerd door gelijktijdig te drukken p75 (low-affiene zenuw groeifactor receptor, LNGFR) en SOX10 tijdens hun migratie van de neurale lijst 2,3,4,5. Deze stamcellen kunnen differentiëren in gladde spiercellen, chroomaffiene cellen, neuronen en gliacellen, evenals melanocyten, kraakbeen en bot 6,7,8,9. Te cultiveren NCSC in vitro, een speciale neurale stamcellen medium (NCSCM) is vereist 10. Het meest complexe deel van de NCSCM is de voorbereiding van de kippenembryo extract (CEE) die een essentiële bron van groei factoren voor de NCSC als voor andere vormen van neurale explantaten. Andere NCSCM ingrediënten naast CEE zijn commercieel verkrijgbaar. Het produceren van CCE met behulp van laboratorium-standaard uitrusting is het van groot belang om te weten over de uitdagende details zoals de isolatie, maceratie, centrifugeren en filtratie processen. In dit protocol beschrijven we accurate technieken om een maximale hoeveelheid van pure en hoge kwaliteit CEE te produceren.
Protocol
Discussion
Dit protocol is gebaseerd op de wijzigingen van de procedures die zijn beschreven in het verleden 10,11. Naast de voormalige publicaties we hier laten zien van de individuele verschillende stappen van het proces meer uitgebreid. Dit ondersteunt de onderzoeker met belangrijke gegevens te verzekeren de juiste procedures en betrouwbare resultaten. Verder, als de dissectie proces is een essentieel onderdeel van CEE extractie beschrijven we de procedure voor het nemen van de embryo's uit de dooierzak in elk de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De ondersteuning en advies van Markus Pajtler en Robert Bohrer waren van onschatbare waarde voor de visualisatie van dit protocol.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 11 days incubated chicken eggs | Sörries-Trockels Vermehrungszucht GmbH & Co.KG | |||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke & Mayr GmbH | |||
| DMEMGlutamax | GIBCO Invitrogen | |||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | |||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One GmbH | |||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | |||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | |||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific AG | |||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One GmbH | |||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
