Un β-glucuronidase (GUS) dosage basé mort cellulaire
Summary
Programmé dosages mort cellulaire couramment utilisés dans les systèmes mammifères tels que l'ADN ou l'échelonnement des essais TUNEL, sont souvent difficiles à reproduire dans les plantes. En combinaison avec un système rapporteur GUS, nous proposons un rapide, usine de dosage basé transitoires pour analyser les propriétés de mort potentielle de gènes spécifiques.
Abstract
Nous avons développé un nouveau système d'expression transitoire plante qui exprime simultanément le gène rapporteur, β-glucuronidase (GUS), avec les régulateurs putatifs positifs ou négatifs de la mort cellulaire. Dans ce système, N. feuilles benthamiana sont co-infiltrée avec une cassette d'expression conduit 35S contenant le gène à analyser, et le vecteur de GUS pCAMBIA 2301 en utilisant la souche d'Agrobacterium LBA4404 comme un véhicule. Parce que les cellules vivantes sont nécessaires pour l'expression de GUS de se produire, la perte de l'activité GUS est attendue lors de ce gène marqueur est co-exprimé avec les régulateurs positifs de la mort cellulaire. De même, augmentation de l'activité GUS est observée lorsque gènes anti-apoptotiques sont utilisés par rapport à la lutte antivectorielle. Comme indiqué ci-dessous, nous avons utilisé avec succès ce système dans notre laboratoire pour analyser les deux joueurs pro et anti-mort. Il s'agit notamment de l'usine anti-apoptotique Bcl-2 Associated athanoGene (SAC) de la famille, ainsi que, connue des inducteurs de mort cellulaire chez les mammifères, tels que BAX. De plus, nous avons utilisé ce système pour analyser la fonction mort de troncatures spécifiques au sein des protéines, ce qui pourrait fournir des indices sur l'éventuelle modification post-traductionnelle / activation de ces protéines. Ici, nous présentons une méthode rapide et sensible des plantes basée, comme une première étape dans l'étude des fonctions mort de gènes spécifiques.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
References
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