Β-глюкуронидазы (GUS) Основываясь Анализ гибели клеток
Summary
Программируемая гибель клеток анализы обычно используется в млекопитающих, таких как laddering ДНК или TUNEL анализы, часто сложно воспроизвести в растениях. В сочетании с системой репортером GUS, мы предлагаем быстрое, на основе растений переходных анализа для анализа потенциальных свойств смерти конкретных генов.
Abstract
Мы разработали новые переходные системы экспрессии растения, которое одновременно выражает ген-репортер, β-глюкуронидазы (GUS), с предполагаемым положительным или отрицательным регуляторы клеточной смерти. В этой системе, Н. benthamiana листья совместно проникли с 35S приводом кассету выражения, содержащего ген, которые будут проанализированы, и GUS вектор pCAMBIA 2301 использованием Agrobacterium штамм LBA4404 как транспортное средство. Потому что живые клетки, необходимые для GUS экспрессия происходит, снижение активности GUS, как ожидается, когда этот маркерный ген является одним из выражены с положительным регуляторы клеточной смерти. Равным образом, увеличилась GUS активность наблюдается при антиапоптотического гены используются по сравнению с переносчиками болезней. Как будет показано ниже, мы успешно использовали эту систему в нашей лаборатории для анализа и про-и анти-смерть игроков. Они включают завод антиапоптотического Bcl-2 Связанные athanoGene (BAG) семьи, а также, известный млекопитающих индукторов гибели клеток, таких как BAX. Кроме того, мы использовали эту систему для анализа смерти функции специфических усечения в белках, которые могли бы пролить свет на возможный пост-трансляционной модификации / активации этих белков. Здесь мы представляем быстрый и чувствительный метод, основанный на заводе, в качестве первого шага в расследовании смерти функции специфических генов.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
References
- Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
- Nishihara, M. Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment. Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).
- Hodal, L. . Plant Science. 87, 115-115 (1992).
- Kabbage, M. The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators. Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).
- Kang, C. H. AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants. Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).
- Yan, J. . Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).
- Takayama, S., Reed, J. C. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).
- Takayama, S. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80 (2), 279-279 (1995).
- Vitha, S. Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).
- Otha, S. Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence. Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).
