Un β-glucuronidasi (GUS) Sulla base di analisi morte cellulare
Summary
Morte cellulare programmata test comunemente usati nei sistemi di mammiferi, come laddering DNA o saggi TUNEL, sono spesso difficili da riprodurre nelle piante. In combinazione con un sistema di giornalista GUS, proponiamo un rapido test basato impianti transitori per analizzare le proprietà morte potenziale di specifici geni.
Abstract
Abbiamo sviluppato un nuovo sistema di espressione transiente pianta che esprime allo stesso tempo il gene reporter β-glucuronidasi (GUS), con putativi regolatori positivi o negativi di morte cellulare. In questo sistema, N. lascia benthamiana sono co-infiltrati con una cassetta 35S espressione guidato contenente il gene da analizzare, e il GUS vettore pCAMBIA 2301 utilizzando LBA4404 ceppo Agrobacterium come veicolo. Poiché le cellule vive sono necessari per l'espressione GUS a verificarsi, perdita di attività GUS è previsto quando questo gene marcatore è co-espresso con regolatori positivi di morte cellulare. Allo stesso modo, un aumento dell'attività GUS si osserva quando i geni anti-apoptotici vengono utilizzati rispetto al controllo vettoriale. Come mostrato di seguito, abbiamo utilizzato con successo questo sistema nel nostro laboratorio per analizzare entrambi i giocatori pro-e anti-morte. Questi includono l'impianto anti-apoptotica Bcl-2 associati athanoGene (UFSP), la famiglia, così come, gli induttori conosciuti mammiferi di morte cellulare, come BAX. Inoltre, abbiamo utilizzato questo sistema per analizzare la funzione morte di troncamenti specifiche all'interno di proteine, che potrebbe fornire indizi sulla possibile modificazione post-traduzionale / attivazione di queste proteine. Qui, vi presentiamo un metodo rapido e sensibile impianto base, come un primo passo nello studio delle funzioni morte di specifici geni.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
References
- Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
- Nishihara, M. Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment. Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).
- Hodal, L. . Plant Science. 87, 115-115 (1992).
- Kabbage, M. The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators. Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).
- Kang, C. H. AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants. Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).
- Yan, J. . Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).
- Takayama, S., Reed, J. C. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).
- Takayama, S. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80 (2), 279-279 (1995).
- Vitha, S. Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).
- Otha, S. Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence. Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).
