A β-glucuronidase (GUS) Tabanlı Hücre Ölümü Testi
Summary
Programlanmış hücre ölümü testleri gibi DNA laddering veya TUNEL deneyleri, memeli sistemlerinde yaygın olarak kullanılan bitkiler üretmek için zor. GUS muhabiri sistemi ile birlikte, biz, belirli genlerin potansiyel ölüm özelliklerini analiz etmek için hızlı bir şekilde, bitki bazlı geçici tahlil öneriyoruz.
Abstract
Biz, aynı anda, hücre ölümünün olası pozitif ya da negatif düzenleyiciler ile muhabir gen, β-glucuronidase (GUS) ifade bir roman geçici bitki ekspresyon sistemi geliştirdik. Bu sistemde, N. benthamiana yaprakları içeren bir analiz edilecek gen 35S tahrik ifade kaset ile birlikte sızmış olan ve GUS vektör pCAMBIA 2301 Agrobacterium gerginlik LBA4404 bir araç olarak kullanarak. GUS ifade canlı hücrelerin oluşması için gerekli olduğundan bu işaretleyici gen, hücre ölümü pozitif düzenleyiciler ile birlikte ifade edilir, GUS aktivite kaybı bekleniyor. Aynı şekilde, anti-apoptotik genlerin vektör kontrol ile karşılaştırıldığında kullanıldığı zaman görülmektedir GUS faaliyet arttı. Aşağıda gösterildiği gibi, başarılı hem de pro-ve anti-ölüm oyuncuları analiz laboratuarımızda bu sistem var. Bunlar gibi BAX hücre ölümü memeli indükleyicileri bilinen anti-apoptotik bitki Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) ailesinin yanı sıra, içerir. Ayrıca, bu proteinlerin muhtemel post-translasyonel değişiklik / etkinleştirme konusunda ipuçları sağlayabilir proteinler içinde belirli kestiği ölüm işlevi, analiz etmek için bu sistemi kullandık. Burada, belirli genlerin ölüm işlevini araştıran bir ilk adım olarak, hızlı ve hassas bir bitki temelli yöntem mevcut.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
References
- Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
- Nishihara, M. Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment. Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).
- Hodal, L. . Plant Science. 87, 115-115 (1992).
- Kabbage, M. The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators. Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).
- Kang, C. H. AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants. Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).
- Yan, J. . Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).
- Takayama, S., Reed, J. C. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).
- Takayama, S. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80 (2), 279-279 (1995).
- Vitha, S. Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).
- Otha, S. Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence. Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).
