Metoder för att bedöma Beta Medierad Celldöd genom Cytotoxiska T-lymfocyter
Summary
Cell-medierad lymphocytotoxicity (KML) analyser kan användas för att testa autoreaktiva svar och mekanismer studie av celldöd in vitro. Däremot kan med hjälp av live-cell konfokala mikroskopiska avbildningstekniker med fluorescerande färger, typ och kinetik av celldöd samt utnyttjade vägar ska studeras mer i detalj.
Abstract
Typ 1-diabetes (T1D) är en T-cell autoimmuna sjukdomar. Under patogenes, patienterna blir successivt mer insulinopenic som insulin produktion gått förlorad, förmodligen Detta beror på förstörelse av betaceller i bukspottkörteln via T-celler. Att förstå mekanismerna av beta celldöd under utvecklingen av T1D kommer att ge insikter för att skapa ett effektivt botemedel mot denna sjukdom. Cell-medierad lymphocytotoxicity (KML) tester har historiskt använt radionuklid Krom 51 (51 Cr) att märka målceller. Dessa mål är sedan utsätts för effektor celler och frisättningen av 51 Cr från målceller läses som en indikation på lymfocyt-medierad celldöd. Hämmare av celldöd resultera i minskad frisättning av 51 Cr.
Som effektor celler, använde vi en aktiverad autoreaktiva klonal befolkning på CD8 + cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) isolerade från en mus lager transgena för både alfa och kedjor beta av AI4 T cell receptor (TCR). Aktiverade AI4 T-celler var co-odlade med 51 märkta Cr celler mål NIT i 16 timmar, Cr utsläpp av 51 noterades att beräkna specifika lys
Mitokondrier delta i många viktiga fysiologiska händelser, såsom energiproduktion, reglering av signalering transduktion, och apoptos. Studien av beta-cellens mitokondrie funktionella förändringar under utvecklingen av T1D är en roman forskningsområde. Med hjälp av mitokondriell membranpotential färga Tetramethyl Rhodamine Metyl Ester (TMRM) och konfokala mikroskopiska levande cell imaging, övervakas vi mitokondriell membranpotential över tiden i beta cellinje NIT-1. För imaging studier var effektor AI4 T-celler märkta med fluorescerande nukleär färgning färg Picogreen. NIT-1 och T-celler gavs samtidigt odlas i chambered coverglass och monteras på mikroskop scenen utrustad med en levande cell kammare, som kontrolleras vid 37 ° C, med 5% CO 2 och fuktig. Under dessa experiment bilderna har tagits från varje kluster var 3 minuter för 400 minuter.
Under en kurs på 400 minuter, observerade vi avledning av mitokondriell membranpotential i NIT-1 cell kluster där AI4 T-celler sattes dit. I samtidig kontroll experiment där NIT-1 celler var co-odlade med MHC mis-matchade mänskliga lymfocyter Jurkat celler, förblev mitokondriell membranpotential intakt. Denna teknik kan användas för att följa i realtid förändringar i mitokondriell membranpotential i celler under attack av de cytotoxiska lymfocyter, cytokiner eller andra cytotoxiska reagenser.
Protocol
Discussion
Cytotoxiska T-cell medierad beta celldöd är den viktigaste patofysiologin vid T1D 5. KML analyser med hjälp av 51 Cr-släpp ger oss möjlighet att studera graden av effektormedierad mål respons 6. Dock är den detaljerade processen och vägar av T-cell-medierade beta celldöd fortfarande inte helt klarlagda. Eftersom mitokondrierna är avgörande för betacellsfunktionen och död 7 har vi fokuserat på mitokondrie-förändringar under den visuella KML. Mitokondriell membra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health DK074656 och AI56374 (CEM), liksom Juvenile Diabetes Research Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass | Fisher | 14-958-A | |
| Gamma Counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT+ | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
- Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
- Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
- Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
- Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).
