जेनेटिक और Epigenetic विश्लेषण के लिए आयल एंबेडेड सामग्री से डीएनए निष्कर्षण

Summary

इस वीडियो formalin-तय आयल एम्बेडेड सामग्री से डीएनए निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल को दर्शाता है. यह एक बहु दिन की प्रक्रिया में जो ऊतक वर्गों xylene के साथ deparaffinized कर रहे हैं, इथेनॉल के साथ rehydrated और proteinase कश्मीर के साथ इलाज के लिए शुद्ध और बाद जीन – विशिष्ट या जीनोम चौड़ा विश्लेषण के लिए डीएनए को अलग है.

Abstract

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures ¹. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion ². Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA ³. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20°C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization ⁴ (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. प्रक्रियात्मक नोट्स</p><ul><li> Xylene और phenol के जहरीले रसायनों और fumehood में नियंत्रित किया जाना चाहिए. उपयोग करने से पहले सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) का संदर्भ लें.</li><li> Xylene कुछ प्लास्टिक घुल, polypropylene ट्यूबों के रूप में वे इन यौगिकों को सहन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.</li><li> विशेष सुझावों खरीदा है कि एक आंतरिक लकड़ी का कोयला डाट शामिल हो सकता है. यह पिपेट में किसी भी रबड़ घटकों को भंग करने से xylene रोकता है. वैकल्पिक रूप से, फिल्टर सुझावों को इस्तेमाल किया जा सकता है.</li></ul><p class="jove_title"> 2. पैराफिन हटाने</p><ol><li> Fumehood में, 5 से 15 मिनट आयल भंग के लिए कोमल झटकों के साथ एक घुमाव पर अपने नमूना और जगह लेबल युक्त ट्यूब के 800 μl xylene (VWR, CABDH6216-4) जोड़ें.</li><liगोली> 3 मिनट के लिए एक microcentrifuge में अधिकतम गति (rpm १४००० या 16 000 XG) पर कताई द्वारा नमूना. ध्यान xylene सतह पर तैरनेवाला वापस लेने और xylene बेकार में त्यागने के लिए एक polypropylene ट्यूब में निपटाने. गोली को परेशान नहीं करने के लिए सावधान रहें.</li><li> Xylene धोने कदम 1 दोहराएँ और 2until आयल पूरी तरह से भंग कर रहा है. यह आमतौर पर दो से तीन washes की आवश्यकता है, ऊतक नमूने के आकार पर निर्भर करता है. एक पूरी तरह से भंग नमूना नरम दिखाई देगा, और कभी कभी अपनी संरचनात्मक अखंडता खो देंगे. नमूने की अखंडता धीरे एक विंदुक टिप के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है.</li></ol><p class="jove_title"> 3. इथेनॉल पुनर्जलीकरण</p><ol><li> 100% (v / v) इथेनॉल आणविक जीव विज्ञान ग्रेड इथेनॉल, भंवर के 800 μl जोड़ें, तो microcentrifuge में 14,000 rpm पर 3 मिनट के लिए स्पिन. इथेनॉल सतह पर तैरनेवाला निकालें, गोली को परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है.</li><li> 70% इथेनॉल 800 μl (100% (v / v) आसुत जल में पतला इथेनॉल (DH जोड़ें<sub2></sub>) O), भंवर, और 14,000 rpm पर 3 मिनट के लिए स्पिन. ध्यान से इथेनॉल सतह पर तैरनेवाला हटा दें.</li><li> 50% इथेनॉल 800 μl (100% (v / v) आसुत जल में पतला इथेनॉल (DH जोड़ें<sub2></sub>) O), भंवर, और 14,000 rpm पर 5 मिनट के लिए स्पिन. ध्यान से pipetting द्वारा संभव के रूप में ज्यादा इथेनॉल के रूप में हटा दें. इस बिंदु पर पूरी तरह से rehydrated ऊतक गोली नहीं होगा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से निर्जलित ऊतक के रूप में गोली परेशान बेहद सावधान रहें.</li><li> 5 मिनट के लिए इथेनॉल सतह पर तैरनेवाला, हवा शुष्क गोली निकालने होने के बाद सावधान खत्म सूखी नहीं है.</li></ol><p class="jove_title"> 4. ऊतक पाचन</p><ol><li> Lysis बफर के 200-500 μl (नीचे सूत्र) जोड़ें. गोली एक विंदुक टिप या एक भंवर का उपयोग कर पुन: निलंबित. इस बिंदु पर अतिरिक्त प्रयास पूरी तरह से फिर से निलंबित – ऊतक नमूना की एक और पूरी पाचन और डीएनए के एक बेहतर उपज में परिणाम देगा.</li><li> 56 में नमूने सेते ° सी में एक पानी स्नान या हीटिंग ब्लॉक.</li><li> ऊतक कोर के लिए, स्पाइक proteinase (20 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान, Invitrogen, AM2548) सुबह और शाम कश्मीर के 20 μl.</li><li> 2 से 5 दिनों के लिए पाचन कदम ऊपर दोहराएँ जब तक ऊतक पूरी तरह से भंग कर रहा है.</li></ol><p class="jove_step"> Lysis बफर</p<ul><li> 10 मिमी Tris – एचसीएल 8.0 पीएच</li><li> 100 मिमी EDTA 8.0 पीएच</li><li> 50 मिमी NaCl</li><li> 0.5% एसडीएस</li><li> 200 μg / एमएल proteinase कश्मीर (बस का उपयोग करने से पहले जोड़)</li></ul><p class="jove_title"> 5. डीएनए साफ</p><ol><li> बफर के एक बराबर मात्रा phenol के संतृप्त (फिशर, BP1750I-400) और उलटा द्वारा मिश्रण जोड़ें. Microcentrifuge में 14,000 rpm पर कम से कम 5 मिनट के लिए स्पिन.</li><li> एक नया ट्यूब जलीय परत स्थानांतरण. Interphase नोट: सफेद सामग्री के एक बहुत कुछ है?</li><li> 1 जलीय अंश पर कदम और 2 दोहराएँ जब तक interphase स्पष्ट है (आमतौर पर 3 या उससे अधिक बार). वापस extractions के प्रदर्शन * जब interphase अंतिम उपज में वृद्धि करने के लिए फजी है.</li><liअपने नमूने के निकाले जलीय अंश isoamyl शराब (25:24:1) (फिशर, BP1752I-400): क्लोरोफॉर्म:> एक बार interphase स्पष्ट है, phenol के एक बराबर मात्रा जोड़ने. 5 मिनट के लिए मिक्स और फिर 5 मिनट के लिए 14,000 rpm पर स्पिन. Thisreduces अवशिष्ट phenol और आगे interphase sharpens, जलीय परत की निकासी की सुविधा</li><li> एक नया ट्यूब जलीय परत निकालें और treatwith RNase एक 100 μg / मिलीलीटर में 37 में 1 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस</li><li> 4 करने के लिए चरण 1 दोहराएँ किसी भी शेष एक RNase हटाने और जलीय अंश इकट्ठा. आप केवल 1 या 2 बफर संतृप्त phenol के कदम की जरूरत के रूप में वहाँ बहुत कम प्रोटीन की तुलना में प्रारंभिक lysate निकालना होना चाहिए.</li></ol><p class="jove_content"> * वापस प्रदर्शन extractions DH के 50-100 μl जोड़ने<sub2></sub> नमूना interphase और जैविक भाग युक्त ट्यूब करने के लिए 0. उलटें ट्यूब मिश्रण करने के लिए, और 5 मिनट के लिए एक microcentrifuge में 14,000 rpm पर नमूना स्पिन. जलीय चरण लीजिए और यह पहले अधिग्रहीत जलीय निष्कर्षण में जोड़ें. वापस extractions जारी रखें जब तक interphase स्पष्ट है.</p><p class="jove_title"> 6. डीएनए वर्षण</p><ol><li> आपके एकत्र जलीय परत की मात्रा का अनुमान है.</li><li> 1 / 10 3 एम सोडियम एसीटेट 5.2 पीएच की मात्रा और 100% isopropanol (v / v) आण्विक जीव विज्ञान ग्रेड (या 100% इथेनॉल 2.5 संस्करणों) की एक मात्रा जोड़ें.</li><li> अच्छी तरह मिक्स और 30 मिनट या रात भर के लिए बर्फ पर या एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में डाल दिया.</li><liअधिकतम गति पर> 4 (14,000 rpm) स्पिन डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए microcentrifuge में</li><li> सतह पर तैरनेवाला त्यागें.</li><li> 70% बर्फ के ठंडे अवांछित लवण हटाने इथेनॉल के साथ गोली धो.</li><li> पुनः निलंबित पसंद के बफर में गोली (आमतौर पर DH<sub2></sub> हे).</li></ol><p class="jove_title"> 7. डीएनए मात्रा का ठहराव</p><ol><li> यों डीएनए की एकाग्रता. A260 A280 अनुपात 1.8 ~ होना चाहिए. डीएनए की छोटी मात्रा के लिए, एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर माप का उपयोग कर पसंद है.</li><li> निम्न मात्रा का ठहराव, जेल वैद्युतकणसंचलन अपने नमूना डीएनए की गुणवत्ता परीक्षण और निर्धारित चाहे contaminating शाही सेना पूरी तरह से अपमानित किया गया है किया जाना चाहिए.</li><li> उच्च गुणवत्ता निकाले डीएनए अब बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, या -20 डिग्री सेल्सियस पर बाद में उपयोग के लिए भंडारित किया जा सकता है. यदि शाही सेना अभी भी आपके नमूने में मौजूद है दोहराने के लिए, डीएनए साफ और वर्षा कदम है, और फिर यों और अपने नमूनों की गुणवत्ता अर्हता प्राप्त.</li></ol>

Discussion

Histopathologic विश्लेषण और निदान के लिए biopsied या शल्य चिकित्सा excised ऊतकों अक्सर लंबी अवधि के भंडारण के लिए formalin निश्चित और आयल एम्बेडेड (FFPE) कर रहे हैं. रोग के आनुवंशिक आधार को समझने में बढ़ती रुचि के साथ, इन नमूनों से डीएनए निकालने की क्षमता नैदानिक ​​सामग्री है कि जीनोमिक विश्लेषण और translational अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक अमूल्य स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है. ऐतिहासिक रूप FFPE नमूने आणविक विश्लेषण के लिए एक व्यवहार्य स्रोत नहीं माना गया न्यूक्लिक एसिड के रूप में भारी प्रोटीन nucleic एसिड और प्रोटीन, ^{प्रोटीन} के पार 6 जोड़ने के द्वारा संशोधित किया जा सकता है. हालांकि, इन मूल्यवान नमूनों की खोज की है कि protease पाचन खंडित न्यूक्लिक एसिड होता है जो पीसीआर, सरणी CGH, अनुक्रमण और मेथिलिकरण रूपरेखा सहित बहाव के विश्लेषण के लिए ^{उपयुक्त} हैं विज्ञप्ति, आनुवंशिक 6 विश्लेषण के लिए उपयोग सक्षम बनाता है.

आयल – एम्बेडेड ऊतकों से डीएनए निष्कर्षण एक मजबूत प्रक्रिया है कि अंतर करने के लिए डीएनए शुद्ध विलेयता पर निर्भर करता है है. निकाले डीएनए गुणवत्ता और मात्रा और बाद में डीएनए प्रवर्धन की सफलता के दौरान और बाद निष्कर्षण पहले मानकों की एक संख्या पर निर्भर है. ये शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं: प्रकार और ऊतकों की राशि, ऊतक संरक्षण के लिए इस्तेमाल किया लगानेवाला के प्रकार निर्धारण की अवधि, आयल ब्लॉक और भंडारण की स्थिति की उम्र, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वांछित डीएनए खंड की लंबाई ^1,7 प्रवर्धित. ऊतक से आयल का हटाया सफल निकासी के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है undissolved आयल के रूप में गरीब नमूना गुणवत्ता और पीसीआर प्रवर्धन के निषेध की ओर जाता है है.

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Xylene	VWR	CABDH6216- 4	–
1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Sorenson BioScience	11510	–
Spectrafuge 16M Microcentrifuge	Labnet	C0160-B	–
Lysis Buffer	–	–	10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K
Proteinase K Stock Solution	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
Proteinase K Stock Solution
Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9	Fisher	BP1750I-400	–
Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Fisher	BP1752I-400	–
RNase A	Roche	10109169001	100mg
3M sodium Acetate pH 5.2	–	–	40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave
ND 3300 Spectrophotometer	NanoDrop	–	–