इस वीडियो formalin-तय आयल एम्बेडेड सामग्री से डीएनए निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल को दर्शाता है. यह एक बहु दिन की प्रक्रिया में जो ऊतक वर्गों xylene के साथ deparaffinized कर रहे हैं, इथेनॉल के साथ rehydrated और proteinase कश्मीर के साथ इलाज के लिए शुद्ध और बाद जीन – विशिष्ट या जीनोम चौड़ा विश्लेषण के लिए डीएनए को अलग है.
Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20°C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.
Histopathologic विश्लेषण और निदान के लिए biopsied या शल्य चिकित्सा excised ऊतकों अक्सर लंबी अवधि के भंडारण के लिए formalin निश्चित और आयल एम्बेडेड (FFPE) कर रहे हैं. रोग के आनुवंशिक आधार को समझने में बढ़ती रुचि के साथ, इन नमूनों से डीएनए निकालने की क्षमता नैदानिक सामग्री है कि जीनोमिक विश्लेषण और translational अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक अमूल्य स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है. ऐतिहासिक रूप FFPE नमूने आणविक विश्लेषण के लिए एक व्यवहार्य स्रोत नहीं माना गया न्यूक्लिक एसिड के रूप में भारी प्रोटीन nucleic एसिड और प्रोटीन, प्रोटीन के पार 6 जोड़ने के द्वारा संशोधित किया जा सकता है. हालांकि, इन मूल्यवान नमूनों की खोज की है कि protease पाचन खंडित न्यूक्लिक एसिड होता है जो पीसीआर, सरणी CGH, अनुक्रमण और मेथिलिकरण रूपरेखा सहित बहाव के विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं विज्ञप्ति, आनुवंशिक 6 विश्लेषण के लिए उपयोग सक्षम बनाता है.
आयल – एम्बेडेड ऊतकों से डीएनए निष्कर्षण एक मजबूत प्रक्रिया है कि अंतर करने के लिए डीएनए शुद्ध विलेयता पर निर्भर करता है है. निकाले डीएनए गुणवत्ता और मात्रा और बाद में डीएनए प्रवर्धन की सफलता के दौरान और बाद निष्कर्षण पहले मानकों की एक संख्या पर निर्भर है. ये शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं: प्रकार और ऊतकों की राशि, ऊतक संरक्षण के लिए इस्तेमाल किया लगानेवाला के प्रकार निर्धारण की अवधि, आयल ब्लॉक और भंडारण की स्थिति की उम्र, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वांछित डीएनए खंड की लंबाई 1,7 प्रवर्धित. ऊतक से आयल का हटाया सफल निकासी के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है undissolved आयल के रूप में गरीब नमूना गुणवत्ता और पीसीआर प्रवर्धन के निषेध की ओर जाता है है.
The authors have nothing to disclose.
हम अपने मूल्यांकन और इस वीडियो और लेख के critiques के लिए लैम प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा के लिए से धन के द्वारा समर्थित किया गया था.
Name | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Xylene | VWR | CABDH6216- 4 | – |
1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | – |
Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet | C0160-B | – |
Lysis Buffer | – | – | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
Proteinase K Stock Solution | |||
Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher | BP1750I-400 | – |
Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher | BP1752I-400 | – |
RNase A | Roche | 10109169001 | 100mg |
3M sodium Acetate pH 5.2 | – | – | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | – | – |